[發明專利]一種蔗糖水解酶突變體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201811425686.3
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109486793B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;郭志勇;李玲玲;姚鍇琳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12P19/14;C12P19/04
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種蔗糖水解酶，屬于基因工程和酶工程領域。本發明對來源于Xanthomonas axonopodis pv.glycines、Janthinobacterium agaricidamnosum NBRC 102515、Caulobacter crescentus NA1000 CB15的蔗糖水解酶進行改造，分別對其第271位或第279位或第281位的絲氨酸殘基進行定點突變，獲得的單突變體酶的轉苷活性較野生型蔗糖水解酶升高。這一發明有助于對于糖苷水解酶轉苷和水解機理的研究，亦可應用于糖苷水解酶工業生產多聚糖。

技術領域

本發明涉及一種蔗糖水解酶突變體及其制備方法與應用，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

蔗糖水解酶(SH,EC 3.2.1.–)，屬于GH13糖苷水解酶家族，是一個很強的水解酶。幾乎沒有轉苷能力，可將蔗糖分子幾乎等比例地水解為葡萄糖和果糖分子。蔗糖水解酶含有5個結構域(A、B、B'、C和N)，其中A、B和B'-結構域構成了蔗糖水解酶的催化核心。

現有的蔗糖水解酶大多水解能力很強，轉苷能力相對比較弱。研究水解和轉苷的決定機制一直是一個熱門的話題。目前，已經有許多關于水解和轉苷的報道，但大多集中在供體和受體位點，能夠顯著改變水解和轉苷平衡的的方法目前報道的還很少。因此，本發明通過單點突變即顯著提高了蔗糖水解酶的轉苷能力，說明此位點對蔗糖水解酶的水解和轉苷作用很重要。進而該位點可以為其他糖苷水解酶的水解和轉苷的改造提供參考和借鑒。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種蔗糖水解酶的突變體，對Caulobacter crescentus NA1000 CB15來源的蔗糖水解酶的第271位絲氨酸進行突變；

或，對Janthinobacterium agaricidamnosum NBRC 102515來源的蔗糖水解酶的第279位絲氨酸進行突變；

或，對Xanthomonas axonopodis pv.glycines來源的蔗糖水解酶的第281位絲氨酸進行突變；

上述突變位點與蔗糖水解酶的轉苷作用和水解作用相關。

在本發明的一種實施方式中，所述來源于Caulobacter crescentus NA1000 CB15蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述來源于Janthinobacteriumagaricidamnosum NBRC 102515蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述來源于Xanthomonas axonopodis pv.glycines蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發明的一種實施方式中，所述突變是將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第271位絲氨酸殘基變為丙氨酸殘基，突變體命名為S271A；

或，所述突變是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第279的絲氨酸殘基變為丙氨酸殘基，突變體命名為S279A；

或，所述突變是將氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的第281的絲氨酸殘基變為丙氨酸殘基，突變體命名為S281A。

編碼所述蔗糖水解酶突變體的基因。

攜帶所述蔗糖水解酶突變體的基因的載體。

攜帶所述蔗糖水解酶突變體的基因的重組細胞。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種蔗糖水解酶的突變體的制備方法，包括如下步驟：

(1)在蔗糖水解酶氨基酸序列的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物，以攜帶蔗糖水解酶基因的載體為模板進行定點突變；構建含突變體的質粒載體；

(2)將突變體質粒轉化進宿主細胞；