[發明專利]高效酶催化合成血根堿與白屈菜紅堿的方法

有效

• 申請號: 201811423227.1
• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109468351B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 黃鵬;曾建國
• 申請（專利權）人: 湖南美可達生物資源股份有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 長沙楚為知識產權代理事務所(普通合伙) 43217
• 代理人: 陶祥琲

一種高效酶催化合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其分別從已知的普羅托品?6?羥基化酶基因、二氫苯并菲啶氧化酶基因及細胞色素P450還原酶基因中通過異源表達和結果比對分析，篩選出表達效率高的最優基因，然后對選出的最優基因進行密碼子優化；再將優化基因序列構建到表達載體上，之后轉入酵母工程菌中進行轉化獲得重組酵母工程菌株；最后用博落回的葉片原料液前體飼喂重組酵母工程菌進行發酵，即得。本發明從基因水平、發酵工藝等多方面上提高血根堿和白屈菜紅堿的酶催化效率，利用博落回的非傳統藥用部位葉片原料液直接與工程菌進行發酵，將葉片中生物堿含量高的原阿片堿和別隱品堿轉化成高價值的血根堿和白屈菜紅堿，以實現博落回資源的綜合利用。

技術領域

本發明涉及血根堿和白屈菜紅堿酶催化合成技術領域，具體涉及一種高效酶催化合成血根堿與白屈菜紅堿的方法。

技術背景

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)屬于罌粟科博落回屬植物，別名又叫號筒桿、落回、山號筒、山梧桐、三錢三等，生長于丘陵、低山、林邊、草地、路旁，是一種野生草本植物。博落回主要分布于中國、東亞、北美洲和歐洲。博落回屬植物包括博落回和小果博落回(M.microcarpa(Maxim)Fedde)兩個種，作為一種傳統中草藥最早見于《本草拾遺》，在民間作為一種殺蛆青草藥而廣泛使用。隨著研究的不斷深入，發現博落回具有抑菌、抗炎、調節畜禽類腸道菌群等多重藥理作用，博落回開始作為一種藥源植物得到越來越廣泛的應用。

博落回中含有的血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿占博落回總生物堿的90％以上。現代藥理研究表明原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿和血根堿具有顯著的生物活性，其中血根堿對治療多種炎癥有效，對畜禽類有較好的腸道菌群調節作用，目前已經作為飼用抗生素的替代品在歐洲等地區廣泛銷售。從2006年1月開始歐盟全面禁止在飼料中添加任何抗生素，導致血根堿的需求逐年增加。目前血根堿的主要來源是從博落回植株中提取，而博落回作為一種野生資源，這種獲取方式導致其野生資源的存儲量逐年減少。

現有的研究結果發現博落回的這4種主要生物堿在博落回中的分布呈現組織特異性。在成熟果莢中血根堿、白屈菜紅堿占總堿的70％左右，原阿片堿和別隱品堿占30％左右；而在葉片中卻相反，血根堿、白屈菜紅堿占總堿的30％左右，原阿片堿和別隱品堿占70％左右。從生物合成途徑上看(附圖1)，原阿片堿和別隱品堿分別是血根堿和白屈菜紅堿的前體物質，原阿片堿在普羅托品-6-羥基化酶(P6H)與輔酶基因CPR一起催化下生成二氫血根堿(DHSAN)，然后二氫血根堿(DHSAN)在二氫苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成血根堿(SAN)；別隱品堿在普羅托品-6-羥基化酶(P6H)與輔酶基因CPR一起催化下生成二氫白屈菜紅堿(DHCHE)，然后二氫白屈菜紅堿(DHCHE)在二氫苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成白屈菜紅堿(CHE)。

血根堿和白屈菜紅堿是博落回提取物中最主要的有效成分，在果莢中含量僅為0.5～2％左右。而葉片中的總生物堿含量大約是果莢中的50％左右，生物學產量是果莢的一倍以上。目前博落回提取物絕大部分來源于野生資源的果莢，來源有限，血根堿含量低，從而造成血根堿價格昂貴，而限制了其產業的發展。另一方面，占總生物堿很大比例的前體類物質未轉化完全，在提取過程中被當成廢棄物未進行綜合高效利用，導致資源的極大浪費。由于每提高0.1％植株中血根堿含量可降低10％的提取成本，而傳統的栽培和育種進行改良所需周期長、受環境影響大、效率低、難以大規模種植和提升潛力有限，通過現代分子生物學技術體外構建工程化菌對前體物向終產物的有效轉化是獲得血根堿的新藥源途徑。

生物轉化(biotransformation)也叫生物催化(biocatalysis)，是指利用微生物全細胞或提取酶作為催化劑對外源底物進行結構修飾或定向合成而獲得有價值產物的生理生化反應，其本質是生物體系中酶的催化反應。這種特定的酶催化反應具有以下特點：(1)具有高度的立體選擇性。(2)反應條件溫和，生產安全，不造成環境污染和后處理簡單。(3)目標明確，副產物少，成本低。(4)微生物轉化可以減少反應步驟。