[發明專利]高效酶催化合成血根堿與白屈菜紅堿的方法

有效

• 申請號: 201811423227.1
• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109468351B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 黃鵬;曾建國
• 申請（專利權）人: 湖南美可達生物資源股份有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 長沙楚為知識產權代理事務所(普通合伙) 43217
• 代理人: 陶祥琲

1.一種高效酶催化合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

S1、對參與血根堿和白屈菜紅堿生物合成的基因進行密碼子優化：首先根據血根堿和白屈菜紅堿的生物合成途徑，分別從已知的普羅托品-6-羥基化酶基因、二氫苯并菲啶氧化酶基因及細胞色素P450還原酶基因中通過異源表達和結果比對分析，分別篩選出表達效率高的最優基因，然后對篩選出的普羅托品-6-羥基化酶基因、二氫苯并菲啶氧化酶基因最優基因進行密碼子優化，具體如下：

從已知的普羅托品-6-羥基化酶基因MC11229和MC11218中通過異源表達和結果比對分析，篩選出表達效率高的最優基因MC11229，然后對篩選出的最優基因MC11229進行密碼子優化得到優化后的基因MC11229opt；其中：MC11229的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，MC11229opt的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，MC11218的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

從已知的二氫苯并菲啶氧化酶基因MC6408和MC6407中通過異源表達和結果比對分析，篩選出表達效率高的最優基因MC6408，然后對篩選出的最優基因MC6408進行密碼子優化得到優化后的基因MC6408opt；其中：MC6408的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，MC6408 opt的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，MC6407的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

從已知的細胞色素P450還原酶基因CuCPR、PsCPR、AtCPR、Mc19967和Mc13802中通過異源表達和結果比對分析，篩選出表達效率高的最優基因CuCPR，CuCPR的核苷酸序列如SEQID No.10所示；

S2、將博落回普羅托品-6-羥基化酶基因優化序列MC11229opt與輔酶基因CuCPR、二氫苯并菲啶氧化酶基因優化序列MC6408 opt一起構建到表達載體上，然后轉入酵母工程菌中，并進行轉化，獲得重組酵母工程菌株；

S3、將博落回的葉片原料液與步驟S3構建的重組酵母工程菌進行發酵，發酵條件為：將博落回葉片原液作為底物，前體飼喂步驟S2構建的酵母工程菌；溫度30°下，發酵培養24小時；然后收集培養后的酵母工程菌，裂解菌體、分離純化，即得血根堿和白屈菜紅堿；

博落回葉片原液的制備方法如下：

(1)將博落回葉片放于35～45℃的恒溫干燥箱中烘干，并粉碎得葉片粉末備用；

(2)然后將制得的葉片粉末按比例加入一定體積pH＝8.0的TE緩沖溶液中，配置呈一定比例的緩沖液；

(3)最后將所述緩沖液先放入高壓蒸汽滅菌鍋中110～120℃滅菌25～35min或者放入超聲波清洗器中超聲25～35min，然后4500～5500rpm離心4～6min，上清液過0.2～0.25μm濾膜，即得。

2.根據權利要求1所述的高效酶催化合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其特征在于，步驟S2中，所述表達載體的質粒選自PYES2。

3.根據權利要求1所述的高效酶催化合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其特征在于，步驟S2中，所述酵母工程菌株的宿主菌選自酵母菌株ivf。