[發明專利]一種黃芪中二硫鍵多肽的純化和鑒定方法

有效

• 申請號: 201811422418.6
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN111217889B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 張曉哲;何枚羲
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 北京元周律知識產權代理有限公司 11540
• 代理人: 周游

本發明涉及一種從黃芪中富集多肽并進行鑒定的方法，是將經鑒定無誤的干燥黃芪切片經醇液超聲提取、過濾、濃縮、萃取、有機試劑富集黃芪中的多肽并通過烷基化處理、質譜分析及De Novo分析鑒定其中的二硫鍵多肽。本發明成功地將傳統的植物化學分析方法、生物化學方法及質譜方法相結合進行多肽富集及檢測，無需脫鹽、超濾分離、特殊色譜柱填料等操作，步驟少、操作簡便，為現代植物多肽的研究提供了技術參考及指導。

技術領域

本發明屬于分離分析及生物技術領域，具體涉及一種將傳統植物提取方法與生物技術結合來富集鑒定二硫鍵多肽的方法。

背景技術

黃芪，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge的干燥根。始載于《神農本草經》，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等作用。現代醫學研究其具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗病毒、抗損傷、降血糖、治療代謝紊亂等活性作用。研究最多的主要活性成分為黃酮類、皂苷類、多糖類成分。

自然界中存在著大量的多肽類化合物，前人更多地關注于動物體中的多肽、蛋白類成分，而在植物中主要研究黃酮、蒽醌、三萜、皂苷、生物堿等類化合物。隨著現代分離及分析技術的飛躍發展，越來越多的植物中多肽類化合物被鑒定得到，且實驗研究發現許多植物多肽類成分具有較強的生物活性，這為新藥研發帶來了更多的可能性。目前，研究發現植物多肽具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老、提高免疫活性、降糖、修復神經損傷等方面的活性，繼而開發了一些具有顯著療效的臨床藥物。

自然界中存在的多二硫鍵肽(常含2-4對二硫鍵，分子量2500-4000)因為結構穩定、空間結構特殊而多具有重要的生理功能以及優異的成藥特性。與線性多肽相比，多二硫鍵肽的種類有限，在動植物中分布稀疏，難以被發現；其結構穩定性高，骨架長，難以被通用的蛋白質組學手段進行序列及結構測定；尤其是多對二硫鍵形成的二硫鍵橋環難以被準確測定。這些因素，導致二硫鍵多肽的發現和結構鑒定成為活性多肽研究領域的一個難點。而植物多肽類藥物具有廣闊的發展前景，由于植物中成分復雜，多肽含量較少，有效分離純化的方法較少等原因導致其發展受到了一定的限制，為改善這一限制條件，越來越多的分離、純化、鑒定方法應運而生，并且取得了良好的效果。目前，多肽、蛋白的分離純化方式還是需要依靠特殊處理，如：尿素提取、酶法制備等，操作較為繁瑣，后處理過程較多。因此，發展一種有效、簡便、快速分離純化的方法是一項非常有價值的研究課題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種黃芪中二硫鍵多肽的純化和鑒定方法，所述方法至少包括以下步驟：

a)制備黃芪提取液；

b)向所述黃芪提取液中加入萃取劑A，得到含有萃取劑A的萃取液和不含萃取劑A的萃取液；

c)向所述不含萃取劑A的萃取液中加入醇類萃取劑B，得到含有醇類萃取劑B的萃取液和不含醇類萃取劑B的萃取液；

d)將所述含有醇類萃取劑B的萃取液濃縮制得干燥物I,然后使所述干燥物I中與混合萃取液C接觸，將所得沉淀物濃縮制得干燥物II；

e)將所述干燥物II分成兩等份干燥物II-1和干燥物II-2；

f)將溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液與二硫蘇糖醇混合反應，制得前驅體1；

g)將所述前驅體1與碘乙酰胺接觸，進行烷基化反應得到前驅體2；

h)向所述前驅體2中加入二硫蘇糖醇，反應結束后除鹽并進行干燥，得到干燥物III；

i)采用質譜技術對所述干燥物II-1和所述干燥物III進行多肽檢測分析

在優選的實施方式中，將所述干燥物II-1的質譜數據用作所述干燥物III的二硫鍵的烷基化多肽質譜數據的內在對照。