[發(fā)明專利]整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株、構(gòu)建方法及應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811421935.1 | 申請日： | 2018-11-27 |
| 公開（公告）號： | CN109468255B | 公開（公告）日： | 2021-10-22 |
| 發(fā)明（設計）人： | 朱國強;區(qū)炳明;金鐸;夏芃芃;朱軍;徐夢嫻;宋浩亮;梁軒;楊穎;朱曉芳 | 申請（專利權(quán)）人： | 揚州大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/90;C12N15/31;A61K35/741;A61P31/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224 | 代理人： | 薛海霞;董建林 |
| 地址： | 225009 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 整合 拷貝 功能 f4 操縱子 基因 益生菌 克隆 構(gòu)建 方法 應用 | ||
本發(fā)明涉及到生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株、構(gòu)建方法及應用，包括如下步驟：pTargetT?
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及到生物技術(shù)應用領(lǐng)域，具體涉及到細菌的染色體整合、穩(wěn)定遺傳表達展示外源功能性F4菌毛蛋白。
背景技術(shù)
大腸桿菌Nissle1917是一株無致病性的益生菌，至今并未發(fā)現(xiàn)對宿主有已知的不益影響，能給予不同宿主健康益處，且該菌株作為在歐洲上市的名為Mutaflor益生菌產(chǎn)品的主要活性成分，主要用于人類腸道健康調(diào)節(jié)。在臨床應用上，益生菌Nissle1917菌株作為基因工程的載體被加以改造，該益生菌已用于疫苗，腫瘤治療，保健品，診斷制劑等方面產(chǎn)品的開發(fā)與研制。EcNc克隆株為大腸桿菌Nissle1917原型野生株基因改造去除其胞內(nèi)兩個隱秘性質(zhì)粒pMUT1和pMUT2，具備比親本株攜帶更多(大)容量的同源或外源基因的特性，已在申請人實驗室制備獲得。
為了實現(xiàn)微生物中同源或異源蛋白或化合物的過量表達生產(chǎn)，大多利用質(zhì)粒的過表達，鑒于這種方法易于操作和調(diào)控的表達而被廣泛使用，但這種方法存在遺傳不穩(wěn)定性。質(zhì)粒的復制，攜帶抗生素抗性基因，過量表達以及其他異源基因等問題所帶來的代謝負擔會導致宿主細胞耗竭，產(chǎn)量損失甚至導致宿主細胞原始功能喪失。此外，為了維持細菌細胞中質(zhì)粒的存在，須使用抗生素或其他選擇性藥劑，從而增加了整個生物加工的成本，同時也增加了耐藥基因傳播的幾率。近年來，細菌染色體表達同源或異源基因在合成生物學和生物醫(yī)學中越來越受青睞。
在細菌染色體組整合同源或外源的DNA基因分子，常用的分子生物學方法包括使用轉(zhuǎn)座子、噬菌體、核酸內(nèi)切酶和重組酶系統(tǒng)，常規(guī)的分子生物學方法在細菌染色體整合基因上具有一定的優(yōu)勢，但也都存在著自身的局限性，如長片段基因難以整合，效率低，脫靶率高等。本申請專利所使用的方法為CRISPR/cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)對益生菌Nissle1917無質(zhì)粒克隆株染色體進行外源大片段DNA基因片段(F4菌毛操縱子基因長約8Kb)的整合。
斷奶仔豬腹瀉(PWD)和仔豬水腫病(ED)為養(yǎng)豬業(yè)臨床上常見的疾病，主要病原菌為F4和F18菌毛陽性產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC，通過菌毛黏附、定植易感仔豬后感染發(fā)病，導致仔豬高死亡率，體重降低，生長緩慢，藥物治療費用昂貴等。臨床上防治該疾病主要運用抗生素治療，但隨著養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)上耐藥菌的產(chǎn)生和累積，急需研究新的防控措施。本專利所構(gòu)建的多功效益生菌Nissle1917無質(zhì)粒克隆菌EcNc穩(wěn)定攜帶遺傳表面表達展示功能性F4菌毛，有望為斷奶仔豬腹瀉的防控提供新思路和策略。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述缺陷，本專利申請為利用益生菌Nissle1917無質(zhì)粒克隆菌EcNc菌株染色體中非必需基因nth/tppB位點單拷貝整合并穩(wěn)定表達F4(K88)菌毛，有望作為由F4+菌株引起的抗仔豬斷奶后腹瀉益生菌活性疫苗候選株。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株，該益生菌克隆株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期為2018.7.2，保藏編號為CGMCC No.16046。
整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
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