[發明專利]整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株、構建方法及應用

有效

• 申請號: 201811421935.1
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109468255B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 朱國強;區炳明;金鐸;夏芃芃;朱軍;徐夢嫻;宋浩亮;梁軒;楊穎;朱曉芳
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/90;C12N15/31;A61K35/741;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

1.整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株，其特征在于，該益生菌克隆株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期為2018.7.2，保藏編號為CGMCCNo.16046。

2.根據權利要求1所述的整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）pTargetT-nth/tppB::P_tetF4重組質粒的構建：

利用pB032-nth/tppB/pB033擴增引物從pTargetF質粒DNA模板中反向PCR擴增含有靶標位點nth/tppB的 N20序列的pTargetF-nth/tppB線性化片段，隨后對所得的線性化片段環化得到第一環化產物，第一環化產物轉化入感受態細胞DH5α 中以構建pTargetT-nth/tppB重組質粒； nth/tppB upsteamHA-F/ nth/tppB upsteamHA-R 和 nth/tppBdownsteamHA-F/ nth/tppB downsteamHA-R擴增引物用來從Nissle1917基因組模板中擴增靶標位點的上游同源臂和下游同源臂；ptetFWD/ ptetF4REV-nth/tppB 擴增引物用于從pBR322-F4 DNA模板中擴增帶有P_tet 啟動子的F4菌毛操縱子基因；IPCRpTargetF-F/IPCRpTargetF-R用來線性化pTargetT-nth/tppB質粒；使用ClonExpress^? MultiS一步克隆試劑盒將靶標位點上下游同源臂、含P_tet啟動子的F4菌毛操縱子基因片段、線性化的pTargetT-nth/tppB片段一起環化得到第二環化產物；第二環化產物隨后轉化進感受態細胞DH5α中以構建pTargetT-nth/tppB::P_tetF4系列重組質粒，nth/tppB為EcNc染色體上特定基因的靶標位點；第二環化產物中，環化連接排列的順序為：靶標位點上游同源臂片段、含P_tet啟動子的F4菌毛操縱子基因片段、靶標位點下游同源臂片段、線性化的pTargetT-nth/tppB片段；

pB032-nth/tppB擴增引物序列為：AGTCCTAGGTATAATACTAGTatattactggaacaacataaGTTTTAGAGCTAGAAATAG；

pB033擴增引物序列為：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG；

含有靶標位點nth/tppB的 N20序列為：ATATTACTGGAACAACATAA；

nth/tppB upsteamHA-F擴增引物序列為：ttctctagagtcgacctgcagTTCGCCGCCAAAAAAGGTCCG；

nth/tppB upsteamHA-R擴增引物序列為：ataatggtttcttagacgtcTTCGCCGTCGCCTTATTAACA；

nth/tppB downsteamHA-F擴增引物序列為：AACACTGCATTCGGCTGGCCG；

nth/tppB downsteamHA-R擴增引物序列為：cagggtaatagatctaagcttCGTGTGTAAATTTAAATGATT；

ptetFWD擴增引物為：gacgtctaagaaaccattattatca；

ptetF4REV-nth/tppB 擴增引物為： GGCCAGCCGAATGCAGTGTTtcagaaatacaccaccaccggtgtc；

IPCRpTargetF-F序列為：AAGCTTAGATCTATTACCCTGT；

IPCRpTargetF-R序列為：CTGCAGGTCGACTCTAGAGAA；

2）通過整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因表達展示在益生菌克隆株菌體表面，得到無抗性的單拷貝F4菌毛基因整合克隆株。