[發(fā)明專利]一種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)抗原的基因分型方法及試劑

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811419215.1
• 申請(qǐng)日: 2018-11-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109402243A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱發(fā)明;許先國(guó);應(yīng)燕玲;洪小珍;陳舒;馬開(kāi)榮;何吉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省血液中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6876
• 分類號(hào): C12Q1/6876;C12Q1/6869
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 梁寅春

快速、準(zhǔn)確的一種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)抗原的基因分型方法，包括步驟：(1)制備基因分型樣本的人基因組DNA；(2)提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)同步擴(kuò)增所述基因組DNA中5個(gè)血型系統(tǒng)12個(gè)抗原對(duì)應(yīng)的基因序列；(3)將步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物作雙酶切純化；(4)提供測(cè)序引物，將步驟(3)所得純化產(chǎn)物分別作測(cè)序PCR反應(yīng)；(5)將步驟(4)所得測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物作醋酸鈉?乙醇沉淀法純化，毛細(xì)管電泳測(cè)序；(6)將步驟(5)所得序列經(jīng)軟件分析，確定其血型抗原基因型；所述擴(kuò)增引物和測(cè)序引物為序列號(hào)1?14的，所述方法所用試劑具有所述擴(kuò)增引物和測(cè)序引物。本發(fā)明用于種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)抗原的基因分型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因分型檢測(cè)方法，尤其涉及一種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)主要抗原基因分型的分子生物學(xué)檢測(cè)方法及該方法所用的試劑。

背景技術(shù)

個(gè)體紅細(xì)胞血型抗原具有遺傳多態(tài)性，到2018年11月已發(fā)現(xiàn)的人紅細(xì)胞血型系統(tǒng)有36個(gè)，超過(guò)350多種抗原。準(zhǔn)確的識(shí)別個(gè)體紅細(xì)胞血型有助于精準(zhǔn)血型的配合。

傳統(tǒng)的鑒定紅細(xì)胞血型的方法是基于抗原抗體凝集的血型血清學(xué)技術(shù)，該技術(shù)在ABO、RhD血型鑒定中得到廣泛應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單易行、試劑成本低廉。但血型血清學(xué)技術(shù)有其局限性，主要表現(xiàn)為：1)檢測(cè)需要新鮮的紅細(xì)胞，不利于標(biāo)本的長(zhǎng)期保存；2)有近期輸血史的待檢者樣本，往往混入ABO/RhD同型但其他血型不相同的輸入性紅細(xì)胞，影響ABO/RhD血型以外的其他血型抗原的準(zhǔn)確鑒定；3)多種血型變異體樣本，應(yīng)用單純的血型血清學(xué)技術(shù)，往往存在分型錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)；4)ABO、RhD以外的血型抗體試劑，普遍產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，不利于大樣本的檢測(cè)；5)某些血型抗原缺乏相應(yīng)的商品化抗體試劑，如Dombrock、Colton、Diego等血型系統(tǒng)的大部分抗原，都沒(méi)有商品化抗體試劑可售。血型基因分型技術(shù)是彌補(bǔ)血型血清學(xué)技術(shù)缺陷的有效方法，早期的血型基因分型多采用等位基因特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)，但這個(gè)方法準(zhǔn)確性較低，后來(lái)又發(fā)展了熒光定量溶解曲線、固相芯片雜交、液相Luminex、測(cè)序分型(PCR-SBT)等技術(shù)。其中以PCR-SBT技術(shù)的準(zhǔn)確性最高，但除了ABO、RhD等血型建立了PCR-SBT方法，大部分的血型系統(tǒng)尚未有PCR-SBT方法進(jìn)行基因分型，而且現(xiàn)有的PCR-SBT血型基因分型方法，往往一次只能對(duì)一種血型進(jìn)行鑒定，檢測(cè)通量較低。因此，建立一種同步檢測(cè)多個(gè)血型系統(tǒng)多個(gè)抗原的PCR-SBT分型方法具有重要價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術(shù)中人類紅細(xì)胞血型抗原基因分型檢測(cè)通量低，耗時(shí)大，準(zhǔn)確率不高等問(wèn)題，為此提供本發(fā)明的一種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)抗原的基因分型方法及試劑，由此解決了5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中12個(gè)抗原準(zhǔn)確定型的問(wèn)題，發(fā)揮PCR-SBT技術(shù)對(duì)多個(gè)血型基因分型的高通量、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，可準(zhǔn)確鑒定個(gè)體紅細(xì)胞血型。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其主題一是一種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)抗原的基因分型方法，二是所述分型方法所用試劑。

本發(fā)明一種同步檢測(cè)5個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)12個(gè)抗原的基因分型方法，其特殊之處在于該方法對(duì)12個(gè)血型抗原進(jìn)行基因分型，并包括以下步驟：

(1)制備基因分型樣本的人基因組DNA；

(2)提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)同管、同步擴(kuò)增所述基因組DNA中5個(gè)血型系統(tǒng)12個(gè)抗原對(duì)應(yīng)的基因序列；

(3)將步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切純化；

(4)提供測(cè)序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物分別進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，所述測(cè)序引物與步驟(2)相應(yīng)的擴(kuò)增引物相同；

(5)將步驟(4)得到的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序；

(6)將步驟(5)獲得的序列通過(guò)軟件分析，確定其血型抗原基因型；