[發明專利]一種同步檢測5個紅細胞血型系統12個抗原的基因分型方法及試劑在審
| 申請號： | 201811419215.1 | 申請日： | 2018-11-26 |
| 公開（公告）號： | CN109402243A | 公開（公告）日： | 2019-03-01 |
| 發明（設計）人： | 朱發明;許先國;應燕玲;洪小珍;陳舒;馬開榮;何吉 | 申請（專利權）人： | 浙江省血液中心 |
| 主分類號： | C12Q1/6876 | 分類號： | C12Q1/6876;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100 | 代理人： | 梁寅春 |
| 地址： | 310052 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 抗原 紅細胞血型 測序引物 基因分型 擴增引物 同步檢測 毛細管電泳測序 聚合酶鏈反應 人基因組DNA 乙醇沉淀法 基因組DNA 測序反應 純化產物 基因序列 擴增產物 軟件分析 同步擴增 血型抗原 血型系統 制備基因 測序PCR 醋酸鈉 基因型 雙酶切 分型 樣本 | ||
1.一種同步檢測5個紅細胞血型系統12個抗原的基因分型方法，其特征在于：所述方法對5個人類紅細胞血型系統的12個抗原進行同步基因分型，所述方法包括以下步驟：
(1)制備基因分型樣本的人基因組DNA；
(2)提供擴增引物，用聚合酶鏈反應同步擴增所述基因組DNA中5個血型系統12個抗原對應的基因序列；
(3)將步驟(2)得到的擴增產物進行雙酶切純化；
(4)提供測序引物，將步驟(3)得到的純化產物分別進行測序PCR反應；
(5)將步驟(4)得到的測序反應產物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；
(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其血型抗原基因型；
步驟(2)中的擴增引物與步驟(4)中相應的測序引物相同，這些引物為：
(1)Kell血型系統K、k抗原編碼基因的擴增和測序引物：
KEL-F:5’-GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA-3’
KEL-R:5’-GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG-3’
(2)Duffy血型系統Fya、Fyb抗原編碼基因的擴增和測序引物：
FY-F:5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’
FY-R:5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’
(3)Duffy血型系統Fy(a-b-)無效表型(Fya和Fyb抗原均陰性)編碼基因的擴增和測序引物：
FYN-F:5’-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3’
FYN-R:5’-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3’
(4)Kidd血型系統Jka、Jkb抗原編碼基因的擴增和測序引物：
JK-F:5’-CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT-3’
JK-R:5’-CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC-3’
(5)Dombrock血型系統Doa、Dob抗原編碼基因的擴增和測序引物：
DO1-F:5’-ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT-3’
DO1-R:5’-TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG-3’
(6)Dombrock血型系統Hy、Joa抗原編碼基因的擴增和測序引物：
DO2-F:5’-ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC-3’
DO2-R:5’-ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG-3’
(7)Colton血型系統Coa、Cob抗原編碼基因的擴增和測序引物：
CO-F:5’-AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT-3’
CO-R:5’-GAC ACC TTC ACG TTG TCC TG-3’。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述5個紅細胞血型系統分別為Kell、Duffy、Kidd、Dombrock、Colton血型系統，其基因名稱分別為KEL、ACKR1、SLC14A1、ART4、AQP1,所述12個抗原分別為K、k、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Doa、Dob、Hy、Joa、Coa、Cob。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
4.一種同步檢測5個紅細胞血型系統12個抗原的基因分型方法所用的試劑，其特征在于：所述試劑具有用于擴增5個血型系統基因的7對引物和用于測序的7對引物，所述用于擴增的引物和用于相應的測序的引物相同，這些引物為：
(1)Kell血型系統K、k抗原編碼基因的擴增和測序引物：
KEL-F:5’-GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA-3’
KEL-R:5’-GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG-3’
(2)Duffy血型系統Fya、Fyb抗原編碼基因的擴增和測序引物：
FY-F:5’-TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC-3’
FY-R:5’-AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC-3’
(3)Duffy血型系統Fy(a-b-)無效表型(Fya和Fyb抗原均陰性)編碼基因的擴增和測序引物：
FYN-F:5’-CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA-3’
FYN-R:5’-CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG-3’
(4)Kidd血型系統Jka、Jkb抗原編碼基因的擴增和測序引物：
JK-F:5’-CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT-3’
JK-R:5’-CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC-3’
(5)Dombrock血型系統Doa、Dob抗原編碼基因的擴增和測序引物：
DO1-F:5’-ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT-3’
DO1-R:5’-TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG-3’
(6)Dombrock血型系統Hy、Joa抗原編碼基因的擴增和測序引物：
DO2-F:5’-ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC-3’
DO2-R:5’-ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG-3’
(7)Colton血型系統Coa、Cob抗原編碼基因的擴增和測序引物：
CO-F:5’-AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT-3’
CO-R:5’-GAC ACC TTC ACG T 。
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