[發明專利]用于光漂白染色細胞的方法

在審

• 申請號: 201811417890.0
• 申請日: 2018-11-26
• 公開（公告）號: CN109959641A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: J.福爾巴赫;C.多澤;T.羅克爾;V.魯道夫
• 申請（專利權）人: 美天施生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;萬雪松

本發明涉及一種用于光漂白染色細胞的方法，具體而言，一種通過用具有檢測部分和抗原識別部分的綴合物標記來自細胞樣品的靶部分或靶細胞，檢測或鑒定所述靶部分或靶細胞的方法，其中在檢測靶部分之后，檢測部分通過用光輻射而降解，從而能夠進行隨后的標記和檢測；以及該方法在熒光顯微術、流式細胞儀、熒光分光光度法、細胞分離、病理學或組織學中的用途。

技術領域

本發明涉及通過用具有檢測部分和抗原識別部分的綴合物標記來自細胞樣品的靶部分或靶細胞，檢測或鑒定所述靶部分或靶細胞的方法，其中在檢測靶部分之后，檢測部分通過用光輻射而降解，從而能夠進行隨后的標記和檢測。

背景技術

與一種或多種抗體綴合的熒光染料通常用于免疫熒光分析。在過去二十年中，在抗體、熒光染料、流式細胞儀、流式分選儀和熒光顯微鏡方面已經開發了大量變型，以能夠進行靶細胞的特異性檢測和分離。

已知利用熒光染料來分離或檢測靶細胞，熒光染料可在檢測后被除去或破壞。例如，US7776562公開了一種基于用可逆肽/MHC-多聚體或Fab-Streptamer間接、非共價標記靶細胞的可逆熒光標記方法。

為了減少檢測后的熒光輻射，GB2372256公開了一種通過提供包含多個經過接頭連接到抗體的熒光染料的綴合物來猝滅熒光輻射的方法。高密度的熒光染料將猝滅熒光信號。此外，GB2372256描述了酶促降解接頭以從綴合物釋放熒光染料。釋放的熒光染料不經歷自猝滅，導致更強的熒光信號，即更好的分辨率。

消除熒光信號對于基于順序染色樣本的免疫熒光技術是必要的。與使用同時標記和檢測的標準程序相比，這些技術已顯示出提供更高的多路復用潛力。然而，這些技術基于通過化學漂白程序氧化破壞綴合的熒光部分(US 7741045 B2、EP 0810 428 B1或DE10143757)，或者在基于光漂白的方法的情況下，漂白速率比這里提出的方法更慢。

現有技術的主要目的是提供染料或包含所述染料的綴合物，該染料發射盡可能強的熒光輻射，即，具有最大量子產率。為了提供可靠和可再現的信號，染料被設計成盡可能穩定。雖然這些性質對于細胞檢測和細胞分離(如FACS過程)是有利的，但它們阻止細胞重復染色和檢測。

發明內容

因此，本發明的一個目的是提供一種增強的方法，該方法用于特異性標記和檢測生物樣本的樣品之中或之上的靶標，并隨后降解檢測部分，以便能夠進行進一步標記和檢測循環。

令人意外地發現，綴合物由通過間隔基與檢測部分連接的抗原結合部分組成，所述檢測部分具有更高的量子產率(并因此具有更高的亮度)和降低的光穩定性二者，如果間隔基是提供有多個低聚物PEG側鏈(即，一定的支化程度)的支鏈PEG低聚物或多聚物，并且檢測部分共價連接于該支鏈PEG，則檢測部分可以容易地被光降解。不受該理論的束縛，據信支鏈PEG低聚物或多聚物“包裹”與其共價連接的檢測部分，導致更緊密的接觸和更高的量子產率，以光誘導氧化破壞檢測部分。

因此，本發明的目的是用于檢測生物樣本的樣品中的靶部分的方法，做法是：

a) 提供至少一種具有通式(I) X_n – P – Y_m的綴合物，其中X是熒光部分，Y是抗原識別部分，n、m是1和100之間的整數，P是包含根據通式I的聚乙二醇的間隔基

(R₇CH₂CHR₅O)-(CR₁R₂CR₃R₄O)_o-(CH₂CHR₆R₈) (I)