[發明專利]一種淚腺干細胞、淚腺干細胞的培養體系和培養方法

有效

• 申請號: 201811415998.6
• 申請日: 2018-11-26
• 公開（公告）號: CN109486766B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 張雁;肖灑
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李小林;李海恬

本發明涉及一種淚腺干細胞、淚腺干細胞的培養體系和培養方法，涉及細胞工程領域。本發明的淚腺干細胞的培養體系以DMEM/F12為基礎培養基，添加以下組分構成培養液：細胞培養添加劑、非必需氨基酸、L?丙氨酰?L?谷氨酰胺、絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路配體、成纖維細胞生長因子、Wnt信號通路配體和ROCK信號通路抑制劑的組合物，并以基質膠作為立體培養的支架。本發明的培養方法為，將小鼠淚腺組織消化成單細胞接種到基質膠中，待其凝固后，加入上述淚腺干細胞培養液中進行原代培養。采用本發明的方法培養的小鼠淚腺干細胞，數量較多，夠穩定持續傳代，并且具備恢復淚腺分泌功能的作用，可有效治療干眼癥。

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，特別是涉及一種三維立體培養體系及采用此培養體系培養的小鼠淚腺干細胞(LGSC)。

背景技術

淚腺是眼部重要器官，主要由分泌腺泡和分泌管組成。淚腺受到交感神經和副交感神經調節，其中大部分是膽堿能神經，少部分是腎上腺素能神經。交感神經源自頸上神經節，副交感神經則與翼腭神經節和睫狀神經節相連接，并且淚腺的某些感覺神經與三叉神經相連。淚腺中有多種乙酰膽堿受體，包括毒蕈鹼受體、I型和II型血管活性腸肽受體及去甲腎上腺素受體α1、β。神經調節下淚腺能分泌溶菌酶，乳鐵傳遞蛋白，脂質運載蛋白，免疫球蛋白A等。

淚腺分泌眼淚，形成淚膜，使眼睛保持濕潤，以保護眼睛。一旦淚腺病變或受到損傷，眼淚分泌不足，人就會患上干眼癥(Dry eye Disease,DED)。人的衰老、自身免疫系統的紊亂、眼部的放療、以及雄性激素水平的降低都會引起淚腺功能失調。干眼癥患者所分泌形成的淚膜比正常淚膜滲透壓高，從而引起角膜炎癥，導致角膜細胞受損、形成潰瘍，最終導致患者視力下降，嚴重影響其生活質量。

對于干眼癥患者，目前的藥物治療方案主要有點滴等滲或低滲的眼藥水，抑制因干眼癥引起的眼結膜和角膜的炎癥發生，阻塞淚孔增加淚膜厚度等。但這些治療只能緩解干眼癥的癥狀，使眼睛盡可能地保持濕潤，避免角膜細胞受到損傷。而且，長時間使用眼藥水和抗炎癥藥物，也會殺傷角膜細胞并且引發更難治愈的炎癥反應。因此，藥物治療并不能從根本上解決淚腺分泌功能失調的問題，不能徹底治愈老化或者病變的淚腺。

為了更有效更徹底地治療干眼癥，研究者們開展了一系列研究，旨在恢復淚腺的分泌功能。要完全恢復淚腺的分泌功能，就需要獲得新的健康細胞或者器官進行移植治療。為了得到用于移植的淚腺細胞，研究者便開始嘗試體外分離培養淚腺干細胞。經過近三十年的努力，淚腺干細胞的體外培養有了突破性的研究，然而，現有的淚腺干細胞體外培養方法分選祖細胞的效率非常低、數量少，并且不能持續傳代培養，大大限制了其臨床應用。因此，需要更加優良的分離方法和培養體系來分離和培養淚腺干細胞，為臨床應用提供良好的技術平臺。

發明內容

基于此，有必要針對現有的淚腺干細胞培養體系和培養方法分選祖細胞效率低、數量少的問題，提供一種淚腺干細胞的培養體系和培養方法，以獲得較多數量的淚腺干細胞，并且該淚腺干細胞能夠進行穩定的傳代培養。

一種淚腺干細胞的培養體系，以DMEM/F12為基礎培養基，添加以下組分構成培養液：細胞培養添加劑、非必需氨基酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路配體、成纖維細胞生長因子、Wnt信號通路配體和ROCK信號通路抑制劑的組合物，并以基質膠作為立體培養的支架。

進一步地，所述細胞培養添加劑為N2和B27的混合物。

所述細胞培養添加劑也可以選用9F，由β-巰基乙醇、2-氨基乙醇、亞硒酸鈉、肝素、轉鐵蛋白、維生素C、胰島素、牛血清白蛋白-油酸和成纖維細胞生長因子-2(FGF2)組成。

進一步地，所述絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路(MAPK/ERK信號通路)配體為EGF，所述成纖維細胞生長因子為FGF10，所述Wnt信號通路配體為Wnt3A，所述ROCK信號通路抑制劑為Y-27632。