[發(fā)明專利]基于類器官方法構(gòu)建卵巢癌移植瘤模型及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811409825.3
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109392843A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪豐;彭存旭;畢研貞;潘紅娜;黃蓉;王全全;張凱;諶通;張鳳梅;上舒振峰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海美峰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 岳泉清

基于類器官方法構(gòu)建卵巢癌移植瘤模型及應(yīng)用，它屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明的目的是以“類器官”培養(yǎng)技術(shù)，以微載體為支架材料，培養(yǎng)出患者來源的卵巢癌細胞?3D材料復(fù)合體，然后直接將細胞?3D材料復(fù)合體接種于正常免疫小鼠皮下，構(gòu)建患者來源的卵巢癌移植瘤模型，從而解決目前人卵巢癌移植瘤模型存在的采用SCID鼠、裸鼠等免疫缺陷小鼠，價格昂貴，不易飼養(yǎng)，成瘤率不高等問題；尤其解決了免疫缺陷小鼠人卵巢癌移植瘤模型無法反映機體免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中所起的重要作用的問題，以及免疫缺陷小鼠人移植瘤模型存在成瘤周期長，難以解決臨床急迫需要藥物治療患者的藥敏需求。本發(fā)明應(yīng)用于小鼠模型構(gòu)建領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及一種醫(yī)學(xué)腫瘤動物模型—基于“類器官”構(gòu)建的患者來源的正常免疫小鼠卵巢癌移植瘤模型及建立該模型的方法，以及它們在醫(yī)藥領(lǐng)域和臨床中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的多發(fā)病和常見病，其發(fā)病機制尚未完全闡明。卵巢癌是最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2018年美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計結(jié)果顯示卵巢癌死亡率仍居女性生殖系統(tǒng)腫瘤的首位。因此通過實驗動物模型進一步探索卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制以及更有效的治療方法意義重大。

新進研究成果類器官(organoids)被評為2017年生命科學(xué)領(lǐng)域最有潛力的“年度技術(shù)”，稱為類器官技術(shù)，類器官是一種微型的三維細胞培養(yǎng)模型，源自患者原發(fā)性腫瘤，并在實驗室中進行培養(yǎng)。從類器官形成之初、到進行藥物治療之后，這些類器官在組織學(xué)、分子水平和功能上能夠持續(xù)與來源腫瘤組織保持高度一致，很好地反映其特點。

長期以來，人類腫瘤細胞系和移植瘤裸鼠動物模型一直作為腫瘤研究和抗癌新藥的研發(fā)平臺，然而，由于細胞系所形成的腫瘤缺少間質(zhì)細胞，而間質(zhì)細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，給腫瘤的基礎(chǔ)研究和有效抗癌新藥的研發(fā)造成很大困難，并且，移植瘤裸鼠動物模型很難準確模擬臨床患者的真實病情，同時，難以滿足臨床前實驗的需要。

近年，國外學(xué)者將患者的新鮮腫瘤手術(shù)標(biāo)本移植到免疫缺陷小鼠，建立了新的模型，命名為腫瘤患者來源的移植瘤(patient-derived xenografts，PDXs)。雖然這些模型成功地再現(xiàn)了患者腫瘤的分子生物學(xué)、組織學(xué)和病理學(xué)特點，但是，因裸鼠缺乏T細胞，SCID鼠同時缺乏T細胞和B細胞，難以闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與機體免疫的關(guān)系，并且不適合研究腫瘤免疫治療，也不是開發(fā)新型抗腫瘤藥物的最理想模型。而患者來源的正常免疫功能小鼠移植腫瘤模型，能彌補因免疫缺陷小鼠缺乏免疫細胞不能準確模擬機體免疫系統(tǒng)對腫瘤免疫攻擊等缺點，從而更準確地還原患者腫瘤組織的分子生物學(xué)特點及腫瘤微環(huán)境，是研究腫瘤的發(fā)病機制和新藥研發(fā)以及臨床精準治療的理想模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以“類器官”培養(yǎng)技術(shù)，采用微載體(NMC2)為支架材料，復(fù)合患者來源的卵巢癌細胞培養(yǎng)出細胞-3D材料復(fù)合體，然后直接將細胞-3D材料復(fù)合體接種于正常免疫小鼠皮下，構(gòu)建體內(nèi)患者來源的卵巢癌移植瘤模型，從而解決目前人卵巢癌移植瘤模型存在的采用裸鼠、SCID鼠等免疫缺陷小鼠不易飼養(yǎng)，價格昂貴，成瘤率不高的問題；尤其是解決了免疫缺陷小鼠人卵巢癌移植瘤模型無法反映機體免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中所起的重要作用的問題，以及免疫缺陷小鼠人移植瘤模型存在成瘤周期長(一般需要3-5個月)，難以解決臨床急迫需要藥物治療患者的藥敏需求。

本發(fā)明的基于類器官方法構(gòu)建卵巢癌移植瘤模型，它是按照以下步驟進行的：

一、獲取人原代卵巢癌腫瘤細胞：取卵巢癌細胞和卵巢癌組織間質(zhì)細胞，以含10％胎牛血清的DMEM、質(zhì)量百分含量為1％青霉素和質(zhì)量百分含量為1％鏈霉素的完全培養(yǎng)液將上述細胞混勻后進行臺盼藍計數(shù)；若臺盼藍計數(shù)活細胞數(shù)>95％，則調(diào)整細胞濃度至2×10⁷/mL，接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶后放入37℃、5％CO²培養(yǎng)箱，得人原代卵巢癌細胞懸液；