[發(fā)明專利]一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811409738.8
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN109535321B
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余細(xì)勇;繆迎羚
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C08F251/00
• 分類號(hào): C08F251/00;C08F230/02;C12N5/00
• 代理公司: 北京英特普羅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11015
• 代理人: 齊永紅

本發(fā)明公開了一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)載體的制備。所述制備方法為：首先利用鄰苯二甲酸酐與殼聚糖反應(yīng)，將氨基保護(hù)，再將其與2?溴異丁酰溴反應(yīng)，得到ATRP大分子引發(fā)劑，并將鄰苯二甲酰胺基團(tuán)脫去，得到Chi?Br大分子引發(fā)劑，最后通過ATRP可控聚合反應(yīng)，得到殼聚糖與聚(2?甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿)接枝物(Chi?PMPC)，即可用作蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染載體。本發(fā)明所使用的主題材料殼聚糖為天然多糖類物質(zhì)，同時(shí)接枝的聚(2?甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿)也是具有仿紅細(xì)胞外表面細(xì)胞膜的脂質(zhì)層結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，因而制備的殼聚糖與聚(2?甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿)接枝物具有很好的生物相容性和材料穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)載體。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染是指把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過程，一般需借助載體幫助目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。目前關(guān)于基因載體的研究較多，而蛋白質(zhì)載體卻鮮有關(guān)注。目前已有報(bào)道的幾種蛋白質(zhì)載體如聚苯乙烯微球、陽離子脂質(zhì)體試劑、多聚精氨酸、聚乙酰亞胺等均存在毒性較高或轉(zhuǎn)染效率有限的問題，因此，需要構(gòu)建一種同時(shí)具備安全低毒和高效轉(zhuǎn)染特性的蛋白質(zhì)載體。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺點(diǎn)，本發(fā)明目的在于提供一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染載體制備方法。其具有作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染載體有很好的生物相容性、血液相容性和材料穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)N-鄰苯二甲酰-殼聚糖(NP-Chi)的制備：將殼聚糖與鄰苯二甲酸酐分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，于氬氣氣氛下攪拌并加熱反應(yīng)制備得到N-鄰苯二甲酰-殼聚糖。

(2)N-鄰苯二甲酰-殼聚糖ATRP大分子引發(fā)劑(NP-Chi-Br)的制備：將步驟(1)中反應(yīng)產(chǎn)物N-鄰苯二甲酰-殼聚糖溶于二甲基亞砜(DMSO)中，加入2-溴異丁酰溴和三乙胺，于室溫下攪拌反應(yīng)得到NP-Chi-Br產(chǎn)物。

(3)殼聚糖ATRP大分子引發(fā)劑(Chi-Br)的制備：將步驟(2)中反應(yīng)產(chǎn)物NP-Chi-Br溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，加入肼一水合物(hydrazine monohydrate)溶液，在氬氣氣氛下攪拌并加熱反應(yīng)得到Chi-Br產(chǎn)物。

(4)殼聚糖與聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿)接枝物(Chi-PMPC)的制備：將步驟(3)中產(chǎn)物Chi-Br和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)溶于DMSO中，于氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入溴化亞銅(CuBr)和聯(lián)吡啶(bpy)，室溫下攪拌反應(yīng)后得到產(chǎn)物Chi-PMPC。

步驟(1)中殼聚糖組分可替換為陽離子功能化或靶向功能化的殼聚糖衍生物，包括PEI改性殼聚糖衍生物、精氨酸改性殼聚糖衍生物、聚賴氨酸改性殼聚糖衍生物、樹枝狀聚賴氨酸改性殼聚糖衍生物、樹枝狀聚酰胺-胺改性殼聚糖衍生物、核靶向肽改性殼聚糖衍生物等。

步驟(1)中N-鄰苯二甲酰-殼聚糖(NP-Chi)的制備可優(yōu)選為以下步驟：將1.0質(zhì)量份殼聚糖與2～5質(zhì)量份鄰苯二甲酸酐分散于20～80體積份DMF中，于氬氣氣氛下攪拌并加熱至110～130℃。反應(yīng)4h～16h后冷卻至室溫，倒入冰水中，抽濾得到沉淀并用冰甲醇徹底洗滌，干燥得到NP-Chi。

步驟(2)中N-鄰苯二甲酰-殼聚糖ATRP大分子引發(fā)劑(NP-Chi-Br)的制備可優(yōu)選為以下步驟：將5.0質(zhì)量份步驟(1)中反應(yīng)產(chǎn)物NP-Chi溶于20～80體積份DMSO中，加入1體積份2-溴異丁酰溴和1.1體積份三乙胺，于室溫下攪拌反應(yīng)2～5d得到過濾洗滌干燥后得黃色固體產(chǎn)物NP-Chi-Br。