[發明專利]一種原核表達重組輪狀病毒抗原P2-VP8的純化方法

有效

• 申請號: 201811409551.8
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109517043B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 黃玲玲;盧晶晶;于佳平;張柳;董曉麗;姜海洋;徐坤;王力
• 申請（專利權）人: 艾美誠信生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/14
• 分類號: C07K14/14;C07K1/18;C07K1/16;C07K1/14
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 趙淑梅;李馨

本發明涉及一種原核表達重組輪狀病毒抗原P2?VP8的純化方法，屬于蛋白質純化技術領域。本發明所述純化方法包括菌體預處理的步驟、柱層析的步驟；其中，所述柱層析的步驟為：①先將預處理后的菌體采用強陰離子填料柱層析，獲得洗脫峰；②再將步驟①所得洗脫峰采用羥基磷灰石填料柱層析，獲得穿透峰。本發明所述純化方法中羥基磷灰石填料柱層析對純度的提升也很明顯，傳統的疏水層析后電泳可見明顯雜帶，純度在90％，羥基磷灰石填料去除雜蛋白的能力較強，電泳條帶單一，無其他雜帶，純度可到99％。

技術領域

本發明涉及一種原核表達重組輪狀病毒抗原P2-VP8的純化方法，屬于蛋白質純化技術領域。

背景技術

輪狀病毒是引起5歲以下兒童急性重癥腹瀉的主要原因，VP8是輪狀病毒表面棘突蛋白最前端的一部分，具有良好的免疫原性，能夠刺激機體產生抗體，有效的中和輪狀病毒，具有很高的研究價值。近幾年對于VP8蛋白純化方法的研究不盡相同，有的是通過融合His標簽后進行親和層析，純化方法相對簡單，但是后期標簽的去除及檢測比較復雜；有的是通過陰離子交換柱和疏水柱進行逐級純化，但是該方法中上樣條件及流動相的選擇較為苛刻，尤其是疏水柱。

發明內容

本發明經初純、QFF層析、CHT I型層析純化原核表達重組輪狀病毒抗原P2-VP8，解決了現有原核表達重組輪狀病毒抗原P2-VP8純化方法工藝復雜、純度低的問題。

本發明提供了一種原核表達重組輪狀病毒抗原P2-VP8的純化方法，所述純化方法包括菌體預處理的步驟、柱層析的步驟；其中，所述柱層析的步驟為：①先將預處理后的菌體采用強陰離子填料柱層析，獲得洗脫峰；②再將步驟①所得洗脫峰采用羥基磷灰石填料柱層析，獲得穿透峰。

本發明優選為所述羥基磷灰石填料柱層析的條件為：將步驟①所得洗脫峰的pH值調節至7.0，上樣量為400mg蛋白質/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，沖洗，線性流速為100cm/h。

本發明優選為所述羥基磷灰石填料柱的預處理方法為：先用0.5M NaOH清洗，再用純化水間隔后，然后用300mM PBS，pH7.0緩沖液再生，最后用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.0，平衡。

本發明優選為所述強陰離子填料柱層析的條件為：上樣量為500mg蛋白質/100mL填料，采用20mM Tris-HCl+0.1M NaCl，pH7.5，洗脫，線性流速為100cm/h。

本發明優選為所述柱層析步驟中強陰離子填料柱的預處理方法為：先用0.5MNaOH清洗，再用20mM Tris-HCl，pH7.5，平衡。

本發明優選為所述菌體預處理的步驟包括發酵獲得菌體、重懸和破碎、超濾；其中，所述超濾為：將重懸和破碎后獲得的胞漿上清通過100K中空纖維柱澄清。

本發明優選為所述發酵獲得菌體為：利用大腸桿菌Rosetta(DE3)發酵誘導表達獲得P2-VP8的發酵液，離心，獲得菌體。

本發明優選為所述重懸和破碎為：先用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡液重懸菌體，再利用高壓勻漿器在50Hz，800-900psi下破碎菌體，12000r/min離心，獲得胞漿上清液。

本發明有益效果為：

①本發明所述純化方法中破碎液在初純階段，離心后進行100K中空纖維柱澄清，有效的去除了大量的雜蛋白，為純化提升了很高的效果；

②本發明所述純化方法中既有收集洗脫峰的方法，也有收集穿透峰的方法，并且首次采用羥基磷灰石填料純化重組輪狀病毒抗原，能夠有效的確保目的蛋白在純化過程中不被大量的稀釋；

③傳統的疏水層析方法回收率較低，而本發明所述純化方法采用羥基磷灰石填料柱層析的回收率高達90％，大幅度提高了收率；