[發(fā)明專利]一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811407107.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN111218400A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;蘇文濤;陳雯雯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12M3/00
• 分類號(hào): C12M3/00;C12N5/073
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發(fā)明提供一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的培養(yǎng)方法，屬于微流控技術(shù)與生殖生物學(xué)的交叉領(lǐng)域。本發(fā)明所用的芯片為凹陷陣列結(jié)構(gòu)的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且芯片表面涂覆有Pluronic F?127，該胚胎培養(yǎng)微流控芯片有助于在體外實(shí)現(xiàn)單個(gè)胚胎定位和培養(yǎng)過程。本發(fā)明所述的胚胎培養(yǎng)芯片與培養(yǎng)方法，能夠顯著提高廢棄胚胎的囊胚發(fā)育率，對(duì)建立人類不同HLA型別的hES庫具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微流控技術(shù)與生殖生物學(xué)的交叉領(lǐng)域，具體涉及一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hES)是由囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercell mass，ICM)分離培養(yǎng)而來的，具有全能分化特性的細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，在細(xì)胞治療、胚胎發(fā)育、藥物篩選、基因治療以及遺傳、表觀遺傳機(jī)制研究等領(lǐng)域具有很需要意義。人類胚胎干細(xì)胞研究始于1998年，它已成為繼人類基因組計(jì)劃后生命科學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域。1998年，美國(guó)威斯康星大學(xué)Thomson實(shí)驗(yàn)室利用36枚臨床治療不孕夫婦捐贈(zèng)的新鮮或冷凍的囊胚，首次成功地分離、建立了5株hES細(xì)胞系(Science，1998，282：1145-1147)。迄今國(guó)際上有美國(guó)、英國(guó)、新加坡、澳大利亞、瑞典、日本、中國(guó)、韓國(guó)等20余個(gè)實(shí)驗(yàn)室建有400株左右hES細(xì)胞，公開發(fā)表的有關(guān)hES細(xì)胞建系的論著有300多篇(Stem Cells，200624(10)，2187-91)，如何提高h(yuǎn)ES建系效率是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

目前hES細(xì)胞的總體建系效率不高，只有5-15％，難以滿足生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的需要。由于人類胚胎來源較為困難，獲得更多hES細(xì)胞系的根本途徑是改善培養(yǎng)體系，提高建系效率。目前hES細(xì)胞的建系基本路線仍然延續(xù)Thomson的方法，即胚胎培養(yǎng)至囊胚后，去除透明帶和滋養(yǎng)層細(xì)胞，分離ICM，接種到飼養(yǎng)層上培養(yǎng)形成原代克隆，然后消化傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，建立干細(xì)胞系，然后進(jìn)行鑒定。在干細(xì)胞建系過程中，有很多因素影響建系效率，如囊胚質(zhì)量、ICM分離方法、傳代方法等等。囊胚質(zhì)量是影響建系效率的主要因素。新鮮的高質(zhì)量囊胚能夠獲得優(yōu)良的ICM，這是建立hES細(xì)胞系的理想來源，然而由于社會(huì)倫理的限制，很難獲得足夠的新鮮囊胚。目前用于hES細(xì)胞研究的囊胚大部分來源于IVF中心廢棄的胚胎。這些發(fā)育遲緩或形態(tài)較差的廢棄胚胎，很少能夠發(fā)育到囊胚期，即使形成囊胚，ICM細(xì)胞數(shù)目也很少，給建系帶來一定困難。

本發(fā)明結(jié)合單胚胎培養(yǎng)微流控芯片，旨在公開一種提高廢棄胚胎囊胚發(fā)育的新方法，提高廢棄胚胎的囊胚形成率及囊胚質(zhì)量，對(duì)建立人類不同HLA型別的hES庫具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片，以及該芯片用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明涉及的一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片該芯片為凹陷陣列結(jié)構(gòu)的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且芯片表面涂覆有Pluronic F-127，其“倒金字塔型”或者“倒V型”凹陷結(jié)構(gòu)的側(cè)壁具有一定的傾斜角度，接種胚胎后，在傾斜側(cè)壁的作用下，迫使細(xì)胞聚集在凹陷結(jié)構(gòu)的底部，可實(shí)現(xiàn)快速、高效、高通量、自動(dòng)捕獲單胚胎并進(jìn)行原位培養(yǎng)以及分析評(píng)價(jià)。

所制備微流控芯片的材質(zhì)為聚合物材料，具體為PDMS、PMMA或PS；所述所述凹陷結(jié)構(gòu)邊長(zhǎng)為100μm～400μm。

一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制備；

(2)Pluronic F-127的涂覆。

所述“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制備；，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)在玻璃或硅片基底表面旋涂200-800微米厚的SU-8光刻膠，95℃前烘2-8小時(shí)，