[發(fā)明專利]一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的培養(yǎng)方法

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• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN111218400A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;蘇文濤;陳雯雯
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12M3/00
• 分類號(hào): C12M3/00;C12N5/073
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片，其特征在于：該芯片為凹陷陣列結(jié)構(gòu)的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且芯片表面涂覆有Pluronic F-127，所述“倒金字塔型”或者“倒V型”凹陷結(jié)構(gòu)的側(cè)壁具有一定的傾斜角度，接種胚胎后，在傾斜側(cè)壁的作用下，迫使細(xì)胞聚集在凹陷結(jié)構(gòu)的底部，可實(shí)現(xiàn)快速、高效、高通量、自動(dòng)捕獲單胚胎并進(jìn)行原位培養(yǎng)以及分析評(píng)價(jià)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片，其特征在于：所制備微流控芯片的材質(zhì)為聚合物材料，具體為PDMS、PMMA或PS；所述所述凹陷結(jié)構(gòu)邊長為100μm～400μm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片的制備方法，其特征在于按照一下步驟進(jìn)行：

(1)“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制備；

(2)Pluronic F-127的涂覆。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片的制備方法，其特征在于所述“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制備，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)在玻璃或硅片基底表面旋涂200-800微米厚的SU-8光刻膠，95℃前烘2-8小時(shí)，

(2)將邊長為200-400微米的正方形的陣列掩膜固定于含有光刻膠的基底表面，并置于可以調(diào)節(jié)傾斜角度以及自由旋轉(zhuǎn)的平臺(tái)上，

(3)紫外曝光時(shí)，可以調(diào)節(jié)平臺(tái)的傾斜角度(15-75度)，同時(shí)每次曝光后平臺(tái)可以以45度或90度的轉(zhuǎn)角旋轉(zhuǎn)后進(jìn)行下一次曝光，

(4)95℃后烘10-30分鐘，自然冷卻后用丙二醇甲醚醋酸酯溶掉未曝光的SU-8膠，形成具有“倒金字塔”樣的陣列模板，

(5)180℃堅(jiān)膜2小時(shí)，最后用此模板制備不同聚合物組成的微流控芯片。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的微流控芯片的制備方法，其特征在于所述Pluronic F-127的涂覆，按照以下步驟進(jìn)行：1)將微流控芯片在無水乙醇中浸泡15-40min，用去離子水沖洗，真空干燥，備用；

2)將清洗好的微流控芯片放入等離子發(fā)生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧氣至10-200Pa，調(diào)整放電功率在5-300W，進(jìn)行射頻放電0.5-10min；

3)在真空狀態(tài)下將一定體積的Pluronic F-127涂覆在芯片表面，孵育2-6小時(shí)(37℃)或者12-24小時(shí)(4℃)；

4)棄去步驟3)芯片表面溶液，并用無菌去離子水沖洗3遍，干燥，封裝，即得。

6.一種用于廢棄胚胎囊胚發(fā)育的培養(yǎng)方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的微流控芯片，按照一下步驟進(jìn)行：

A.取得保存在胚胎庫中的在體外授精或單精注射后第三天的不適宜進(jìn)行胚胎移植或冷凍的低質(zhì)量胚胎；

B.將該胚胎置于微流控芯片中進(jìn)行培養(yǎng)，胚胎懸液以1×10³個(gè)/mL的胚胎密度加入芯片表面，利用負(fù)壓驅(qū)動(dòng)和重力作用，將單個(gè)胚胎引入單個(gè)捕獲阱內(nèi)；待胚胎沉降至捕獲阱底部凹陷，在上面覆蓋新鮮培養(yǎng)基，并覆蓋礦物油以防止蒸發(fā)，37℃、5％CO₂、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)；

C.將廢棄胚胎在上述胚胎微流控芯片中培養(yǎng)5-6天，每兩天進(jìn)行培養(yǎng)基更換，為胚胎補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)，排出代謝廢物；每天觀察胚胎發(fā)育情況直至第7天，并且對(duì)形成的囊胚進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)方法參照Gardner的囊胚分級(jí)法。