[發(fā)明專利]用于檢測A型豬輪狀病毒的引物及探針、熒光定量PCR試劑盒及方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811405230.0
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109234465A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李曉菲;秦立廷;陳婷;孫愛榮;魏笑笑
• 申請（專利權(quán)）人: 山東新希望六和集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種用于檢測A型豬輪狀病毒的引物及探針、熒光定量PCR試劑盒及方法和應(yīng)用，其中，引物的核苷酸序列如下：上游引物：5'GAATGCAGTTAAGACAAATGC 3'，下游引物：5'GTTACTTGAAGGTCGTGATTG 3'；探針的序列如下：5'FAM?AATCCATAGACACGCCAGCGTCT?BHQ1 3'。本發(fā)明的有益效果是：使用本發(fā)明的試劑盒能夠快速、準確地實現(xiàn)對A型豬輪狀病毒的檢測；本發(fā)明的試劑盒在3.18x10²?3.15x10⁹copies·μL^?1模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，敏感性是常規(guī)PCR的100倍；特異性良好，與其他常見豬病病毒無交叉反應(yīng)；重復(fù)性試驗變異系數(shù)小于1.4%；與常規(guī)PCR方法相比，該方法對臨床樣品的陽性檢出率更高；綜上所述，該方法特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好，為A型豬輪狀病毒的實驗室鑒別診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、準確的檢測手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒PCR檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測A型豬輪狀病毒的引物及探針、熒光定量PCR試劑盒及PCR檢測體系構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

A型豬輪狀病毒 (Porcine rotavirus-A，PoRVA)屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，主要引起1～4周齡仔豬發(fā)生腹瀉，臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、腹瀉和脫水等，育成豬和成年豬多為隱性感染。PoRVA 在全球廣泛分布，調(diào)查發(fā)現(xiàn)其個體流行率為3.3%～67.3%，場陽性率為1%～74%。PoRVA引起的腹瀉疾病在我國部分地區(qū)不時發(fā)生和流行，且PoRVA常與其他病毒混合感染，對我國養(yǎng)豬業(yè)具有很大危害性。PoRVA感染豬引起的腹瀉癥狀與其他的豬腹瀉類病毒癥狀非常相似，在臨床上很難區(qū)分，必須依靠實驗室檢測進行確診。因此，建立一種快速有效的PoRVA特異性檢測方法，對于PoRVA的鑒別診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

目前，PoRVA臨床樣品常用的實驗室診斷方法主要有RT-PCR、病毒分離鑒定以及序列測定等。這些常規(guī)方法操作繁瑣并且檢測耗時長，有的需要5-7天甚至更長的時間才能出結(jié)果。另外這些常規(guī)方法在用于PoRVA檢測時在特異性和敏感性方面存在不足，尤其體現(xiàn)在病毒感染初期病毒含量較低的時候。熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上引入了熒光探針，使得檢測方法具有更高的特異性和敏感性，并且PCR結(jié)束后可以直接觀察結(jié)果，無需進一步凝膠電泳。整個過程操作簡單，用時短，已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用于病原檢測領(lǐng)域。

本發(fā)明根據(jù)GenBank中PoRVA基因序列設(shè)計一對特異性引物和一條特異性TaqMan探針，建立了一種快速檢測PoRVA病毒載量的特異性TaqMan熒光定量PCR方法。通過對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化，使得該方法在3.18x10²-3.15x10⁹copies·μL^-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍。利用所建立的熒光定量PCR方法可以在2-3h內(nèi)快速準確地對樣品中的PoRVA進行檢測，既能進行定性檢測，又能準確定量。而且與常規(guī)PCR方法相比，該方法可對其結(jié)果進行實時監(jiān)控，無需進一步進行凝膠電泳分析。該方法的建立為PoRVA的實驗室鑒別診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、準確的檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容

為了能夠提供一種更加快速、特異及敏感的PoRVA檢測方法，為PoRVA的快速特異性檢測及其流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防和控制我國PoRVA的流行提供可靠的技術(shù)工具，本發(fā)明提供了一種用于檢測PoRVA的特異性引物及探針、熒光定量PCR試劑盒及方法和應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種用于PoRVA特異性檢測用引物及探針，其中：

所述引物序列如下：

上游引物： 5' GAATGCAGTTAAGACAAATGC 3'，

下游引物： 5' GTTACTTGAAGGTCGTGATTG 3'；

所述探針序列如下所示：