[發(fā)明專利]用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的引物及探針、熒光定量PCR試劑盒及方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811405230.0
• 申請(qǐng)日: 2018-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN109234465A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉菲;秦立廷;陳婷;孫愛(ài)榮;魏笑笑
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東新希望六和集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的引物及探針，其特征在于，

所述引物序列如下所示：

上游引物： 5' GAATGCAGTTAAGACAAATGC 3'，

下游引物： 5' GTTACTTGAAGGTCGTGATTG 3'；

所述探針序列如下所示：

5' FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ1 3'。

2.用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，其特征在于，所述試劑包括以下組分：反應(yīng)混合液、水和用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的引物和探針；

所述引物序列如下：

上游引物： 5' GAATGCAGTTAAGACAAATGC 3'，

下游引物： 5' GTTACTTGAAGGTCGTGATTG 3'；

所述探針序列如下所示：

5' FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ1 3'。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，其特征在于，所述反應(yīng)混合液為TaKaRa公司生產(chǎn)的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的PCR檢測(cè)試劑，其特征在于，所述水為TaKaRa公司生產(chǎn)的RNase-free Water。

5.一種制備檢測(cè)A型豬輪狀病毒的熒光定量PCR試劑盒，為含有權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的熒光定量PCR檢測(cè)試劑的試劑盒。

6.如權(quán)利要求1所述引物及探針、或如權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述檢測(cè)試劑、或如權(quán)利要求5所述試劑盒，在檢測(cè)A型豬輪狀病毒或制備檢測(cè)A型豬輪狀病毒檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

7.用于檢測(cè)A型豬輪狀病毒的熒光定量PCR檢測(cè)體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：

（1）設(shè)計(jì)合成引物和探針；其中，所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物： 5' GAATGCAGTTAAGACAAATGC 3'，

下游引物： 5' GTTACTTGAAGGTCGTGATTG 3'；

所述探針序列如下所示：

5' FAM-AATCCATAGACACGCCAGCGTCT-BHQ1 3'；

（2）制備陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

（3）進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立熒光定量PCR檢測(cè)體系。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（2）具體為：

用DNA/RNA核酸共提試劑盒提取樣品中的總RNA，取5.5μL總RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為25℃保持10min、42℃保持30min，所得產(chǎn)物為cDNA，可直接用于熒光定量PCR或置-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

以上下游引物通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增A型豬輪狀病毒目的基因，產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α大腸桿菌，通過(guò)序列測(cè)定獲得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；測(cè)定DNA濃度后，換算成拷貝數(shù)，并稀釋至10¹⁰copies?μL^-1，-20℃保存，用前稀釋作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（3）中，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為： 95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40個(gè)循環(huán)。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（3）中，所述熒光定量PCR檢測(cè)體系共為25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-freewater，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。