[發明專利]一種定量檢測窖泥中甲烷菌含量的方法

在審

• 申請號: 201811403485.3
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109251989A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 袁木;何宏魁;張治洲;蔡照潤;曹潤潔;李安軍
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學（威海）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

本發明屬于生物技術及食品發酵領域，是一種涉及利用特異性引物定量檢測濃香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，本發明針對目標甲烷菌在某個分類層面(門綱目科屬種六個分類層面均可以)上16S rDNA的特異性，設計出目標甲烷菌的特異性引物。該方法包含以下步驟：(1)目標甲烷菌特異性引物的設計；(2)不同窖泥樣本的采集及其宏基因組提取；(3)利用目標甲烷菌特異性引物對上述基因組樣本進行QPCR(quantitative polymerase chain reaction)擴增來定量檢測不同濃香型白酒窖泥樣本中甲烷菌的含量。本發明基于目標甲烷菌16S rDNA的特異性SNP(single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態性)和SAP(simple allele discriminating PCR)技術設計屬特異性PCR(polymerase chain reaction)引物的方法，提供了一種可行的從復雜菌群中利用特異性引物檢測甲烷菌的分子生物學方法。

技術領域

本發明屬于生物技術及食品發酵領域，是一種涉及特異性引物定量檢測濃香型白酒窖泥中甲烷菌的方法。

背景技術

在白酒的釀造過程中，窖泥作為微生物的載體，發揮著重要的作用。窖泥中的各種微生物在發酵的厭氧條件下相互維持著群落的平衡，形成特殊的生態系統，對于酒類的發酵程度和風味塑造起著決定性的作用。隨著分子生物學的發展，由于16S rRNA基因在物種進化過程中具備高度保守性，人們積極利用16S rRNA基因來確定微生物門綱目種屬等分類學信息，對未培養或不能培養的微生物16S rRNA基因進行PCR擴增成為了主要的方法，特別是極端環境下生長的微生物，例如甲烷菌。甲烷菌是專性嚴格厭氧菌，生長繁殖特別緩慢，培養分離比較困難，在實驗室模擬它們的生長條件是很困難的；而在以往對濃香型白酒窖泥菌群的系列分析結果表明，甲烷菌在產香等發酵過程中具有重要作用，所以需要對其進行深入研究。

甲烷菌屬在濃香型白酒窖泥中的含量分布情況比較類似，既有的檢測報道一般是3-6個屬。比如五糧液酒的窖泥中曾報道了4個優勢甲烷菌屬，分別為Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanoculleus和Methanosarcina，其中Methanosarcina可同時利用乙酸和H₂。四川綿陽豐谷酒業的窖泥中含有至少5個甲烷菌屬，分別是Methanoculleus(甲烷袋狀菌屬,本文稱之為甲烷囊菌屬，參見百度百科)、Methanosarcina(八疊球菌屬)、Methanobacterium(甲烷桿菌屬)、Methanocorpusculum(甲烷粒菌屬)和Methanomicrobiaceae(甲烷微菌屬)。四川瀘州某公司白酒生產窖池中發現至少有6個甲烷菌屬，分別是Methanobrevibacter、Methanosata、Methanoculleus、Methanobacterium、Methanocorpusculum和Methanothri，而瀘州老窖的百年窖泥中至少含有4類不同的甲烷菌屬，分別是甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)和甲烷囊菌屬(Methanoculleus)。顯然，不同的濃香型白酒在日常質控過程中需要對不同組合的甲烷菌屬設計特異性(快速)檢測技術。

甲烷菌的特異性檢測已經有不少報道。比如，韋艷霞等人試圖研究根管感染中產甲烷古細菌的多樣性，利用甲基輔酶M還原酶(methyl coenzyme M reductase，MCR)基因α亞基(mcrA)的特異性引物，發現所選樣本中產甲烷古細菌的多樣性局限于類口腔甲烷短桿菌序列型。華金玲等也是利用MCR基因特異性基因引物發現黃淮白山羊瘤胃中的甲烷菌主要是瘤胃甲烷桿菌。蘭阿峰等利用甲烷菌16S rDNA特異性引物Met86F和Met1340R測定了野生秦嶺羚牛瘤胃中甲烷菌種類，發現包括了至少3個科，若干個屬，其多樣性比較豐富。