[發明專利]一種定量檢測窖泥中甲烷菌含量的方法

在審

• 申請號: 201811403485.3
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109251989A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 袁木;何宏魁;張治洲;蔡照潤;曹潤潔;李安軍
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學（威海）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

1.一種定量檢測濃香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，其特征在于該方法包含以下步驟：

(1)目標甲烷菌特異性引物的設計；

(2)不同窖泥樣本的采集及其宏基因組提取；

(3)利用目標甲烷菌特異性引物對上述基因組樣本進行QPCR擴增來定量檢測不同樣本中甲烷菌的含量。目標甲烷菌或目標甲烷菌屬這里指六個分類層面(門綱目科屬種)任意一個層面上的一組甲烷菌均可以。菌屬字眼只是通俗的稱謂，并不局限于屬這個分類層面。

2.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于目標甲烷菌特異性引物，其設計方法如下：以濃香型白酒窖泥中某個特定的的甲烷菌屬為研究對象，經過對窖泥中含量最多的前三十個菌屬的16SrRNA全長代表序列、目標甲烷菌屬的16SrRNA全長代表序列和數據庫搜索挑選的目標甲烷菌屬16SrRNA全長其他序列使用MAFFT(MultipleAlignmentusingFastFourierTransform，https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)多序列比對分析，找出目標甲烷菌屬的全部singlenucleicpolymorphism(SNP)位點。對全部SNP位點進行目標甲烷菌屬內和菌屬外可行性驗證，找出3-5個最好的SNP位點，以此基礎上再選擇最佳的一個SNP位點進行特異性引物設計。原則上可以設計多對目標甲烷菌屬特異性引物。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，使用SNP位點和擴展性SAP(simpleallelediscriminatingPCR)方法設計引物。根據SAP理論的一般設計方法，引物的3’端末端應該是SNP位點，在SNP位點的前一位點(引物的倒數第二位)人為的引入錯配，這樣一來引物與靶序列(目標甲烷菌屬)只有在倒數第二位有錯配，而與非靶序列在最后兩個堿基位點都是錯配。如此就可以通過合適的擴增條件使得非靶序列不能得到有效的擴增。本專利基于該理論在錯配的位置做了稍許擴展性調整，即SNP位點只需要放置在引物3’端的末2位(不一定是最后一位，可以是倒數第二位)，錯配位置也放在末位，不一定是倒數第二位(也可以是倒數第三位附近)，宗旨是讓引物與靶序列在引物的3’末端2-4個堿基的配對強度大于非靶序列即可。引物的特異性經過PCR擴增及產物測序驗證，確定特異性無誤的引物可以進一步用于QPCR(quantitativePCR)再驗證，要求QPCR的熔接曲線為單峰且沒有明顯的二聚體擴增。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，依據上述方法為一組特定的甲烷菌(甲烷囊菌屬)設計了兩對引物，其核苷酸序列為：

Met1-f5’-TCACCAGAACGGCTTCGATAGT-3’，

Met1-r5’-GCGAGTTACAGCCCACAATCC-3’；

Met2-f5’-CGGAGTTGGATTCTGAGACACG-3’，

Met2-r5’-CCAGCTTTCGTCCTTCGCT-3’。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用的領域為食品發酵領域。