[發明專利]類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法

在審

• 申請號: 201811403102.2
• 申請日: 2018-11-19
• 公開（公告）號: CN109266738A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 郝慧琴;李振;高玉亭;王澤
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及生物醫療技術領域，公開了類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，準備好試驗動物及其組織后，提取CIA大鼠關節總RNA，檢測總RNA純度、濃度，對總RNA反轉錄，合成5對特異性引物，以CIA大鼠cDNA為模板，使用15μL體系PCR檢測，在凝膠成像系統中，隔離板將紫外線隔開，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF?κB cDNA片段的凝膠，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，將回收出來的DNA片段連接至T?Vector，轉化后藍白斑篩選及測序。本發明建立CIA大鼠模型，利用分子生物學手段檢測類風濕關節炎大鼠關節中核因子κB亞基p65、Toll樣受體4、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1、白介素6、核因子κB亞基等關鍵炎癥因子的表達，對于實現早期預防和治療RA具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及生物醫療技術領域，特別涉及類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法。

背景技術

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一類常見免疫系統炎性疾病，影響全世界約1％的人群。RA表現為持久滑膜炎、全身性炎癥，持續不斷地產生自身抗體。其發病的確切病因尚不清楚，但環境及遺傳因素參與了RA的發病。目前國際公認RA的一線治療策略，是抗風濕藥物早期聯合使用，改善病情，控制RA發作，降低致殘率，但仍有約30％的患者不能緩解，不受控制的活動期RA可以引起關節損壞、致殘、生活質量降低、心血管病和其它并發病，這些問題也會加重病人焦慮情緒并使得病人不得不忍受情緒的低潮以及經濟方面帶來的巨大負擔。

發明內容

發明的目的在于提供類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，本發明建立CIA大鼠模型，利用分子生物學手段檢測類風濕關節炎大鼠關節中核因子κB亞基p65(RelA)、Toll樣受體4(TLR4)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、白介素6(IL6)、核因子κB亞基(NF-κB)等關鍵炎癥因子的表達，本發明對于實現早期預防和治療RA具有重要的意義，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，包括如下步驟：

S1：準備試驗動物及其組織

選取24只42±2日齡健康狀況良好、體重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為2個試驗組：I組，空白對照組(n＝12)：飼喂基礎日糧+水；II組，CIA模型組(n＝12)：多點皮下注射牛II型膠原；

S2：總RNA的提取

依據RNAiso Plus實驗操作說明提取CIA大鼠關節總RNA；

S3：總RNA濃度的測定

NanoDrop ND-2000檢測總RNA純度、濃度

S4：cDNA合成

按照SYBR PrimeScript^TM RT Reagent Kit試劑盒操作說明進行，對總RNA反轉錄；

S5：引物設計與合成

參照已登錄大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κB cDNA序列，利用Primer Premier5.0軟件結合NCBI Blast在線引物設計，合成5對特異性引物；

S6：凝膠電泳檢測

以CIA大鼠cDNA為模板，使用15μL體系PCR檢測；

S7：回收和純化PCR產物

在凝膠成像系統中，隔離板將紫外線隔開，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κB cDNA片段的凝膠，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收；