[發明專利]類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法

在審

• 申請號: 201811403102.2
• 申請日: 2018-11-19
• 公開（公告）號: CN109266738A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 郝慧琴;李振;高玉亭;王澤
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：準備試驗動物及其組織

選取24只42±2日齡健康狀況良好、體重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為2個試驗組：I組，空白對照組(n＝12)：飼喂基礎日糧+水；II組，CIA模型組(n＝12)：多點皮下注射牛II型膠原；

S2：總RNA的提取

依據RNAiso Plus實驗操作說明提取CIA大鼠關節總RNA；

S3：總RNA濃度的測定

NanoDrop ND-2000檢測總RNA純度、濃度

S4：cDNA合成

按照SYBR PrimeScript^TM RT Reagent Kit試劑盒操作說明進行，對總RNA反轉錄；

S5：引物設計與合成

參照已登錄大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κB cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件結合NCBI Blast在線引物設計，合成5對特異性引物；

S6：凝膠電泳檢測

以CIA大鼠cDNA為模板，使用15μL體系PCR檢測；

S7：回收和純化PCR產物

在凝膠成像系統中，隔離板將紫外線隔開，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κBcDNA片段的凝膠，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收；

S8：目的片段與載體連接

按照pMD18-T試劑盒使用說明將回收出來的DNA片段連接至T-Vector；

S9：轉化

S10：藍白斑篩選及測序

第2d轉化的平板中，一部分長有藍斑，一部分長有白斑，挑取白色單菌落，放入含AMP的LB液體培養基中，37℃ 150r/min恒溫搖蕩，當白色云霧時將其取出，4℃保存，菌液交由公司進行序列測定。

2.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，其特征在于，S1的所有Wistar大鼠日糧均為大小鼠商品飼料，自由采食、自由飲水，試驗時間為28d，所有試驗Wistar雌性大鼠在預飼7d后進入正式試驗期，正式試驗為期21d，飼喂結束后，麻醉、殺檢、腹主動脈取血備用；采集2個不同試驗組Wistar雌性大鼠關節的相同部位，放入DEPC水處理過的離心管，迅速置于液氮中保存。

3.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，其特征在于，S2的操作步驟如下：

S2-1：在試驗開始前，高溫高壓條件下，將試驗所需的所有玻璃器皿滅菌，用0.1％DEPC水將提取RNA所需的所有EP管、槍頭等浸泡12-18h，121℃高壓滅菌15min，60℃真空烘干備用；

S2-2：從-80℃冰箱中取出樣品后迅速稱量，使用液氮預冷的研缽研磨組織；

S2-3：在研磨好的組織中加入1000μL RNAiso Plus，20℃放置5-10min；4℃ 12,000r/min(或13,000g)高速離心5min，取上清于新的1.5mL EP管中；

S2-4：上清中加入200μL氯仿，振蕩混勻，20℃放置5-10min；4℃12,000r/min(或13,000g)高速離心15min；

S2-5：液體分3層，上層是核酸，第2層是蛋白，第3層是氯仿，吸取上層液相于新EP中，加入200μL異丙醇，常溫靜置10min，4℃ 12,000r/min離心10min；將上清液倒掉，底部白色沉底即為總RNA；

S2-6：向沉淀中加入1mL75％乙醇，白色沉淀懸浮，4℃ 12,000r/min離心5min，倒掉上清液，超凈工作臺中干燥5-10min，加入30-50μL RNase-free H₂O，溶解RNA，測定RNA OD值和濃度，-80℃保存。

4.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子檢測引物及其方法，其特征在于，S4的反應條件：37℃ 15min，85℃ 5sec，測定反轉錄產物進行濃度，符合試驗要求后，-20℃保存。