[發明專利]一種同時檢測甲、乙型流感、副流感的PCR試劑盒

在審

• 申請號: 201811402860.2
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109957624A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 張鵬
• 申請（專利權）人: 張鵬
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由混合反應物（2X）（包括Taq熱啟動DNA聚合酶、UNG酶、TaqMan熒光探針、PCR緩沖液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、MgCl2等）、酶混合物（20X）（Luna溫啟動逆轉錄酶和小鼠RNase抑制劑）、正向引物、反向引物、陽性質控品和無RNase水組成；其中，混合反應液中包括有甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的特異性保守序列的引物及TaqMan熒光探針；

所述特異性保守序列的引物序列為：

甲型流感病毒，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

乙型流感病毒，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

副流感病毒，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

所述特異性保守序列的TaqMan探針序列為：

甲型流感病毒，SEQ ID NO.3；

乙型流感病毒，SEQ ID NO.6；

副流感病毒，SEQ ID NO.9。

2.根據權利要求1所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述混合反應液所述引物在擴增體系中的終濃度為100～900nM；所述探針在擴增體系中的終濃度為100～500nM，Taq熱啟動DNA聚合酶（1～2U/μL）、Luna溫啟動逆轉錄酶、UNG酶在擴增體系中的終濃度為0.5U～5U。

3.根據權利要求1所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述的 Luna溫啟動逆轉錄酶是經過設計，比許多其他RT更高的熱穩定性，可使最佳反應溫度達到55℃，對于困難的目標/模板，可以使用高達60°C的較高RT步驟溫度；Luna溫啟動逆轉錄酶和Taq熱啟動DNA聚合酶利用一種對溫度敏感、可逆的適配體在45℃以下抑制其活性；因此，可以在室溫下建立反應并抑制非特異性擴增。

4.根據權利要求1所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述的混合反應物由獨特的被動參比染料配制而成，可與各種qPCR儀器平臺兼容，包括需要ROX校正的儀器，實驗操作過程中不再需要額外的染料。

5.根據權利要求1所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述的混合反應物含有dUTP，qPCR / RT-qPCR前用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）預處理，通過切除尿嘧啶堿基以產生不可擴增的DNA產物來消除先前擴增的含尿嘧啶的產物；所以，在反應混合物中加入0.025單位/μL的NEB的南極熱敏UDG，可以實現防止產物殘留污染。

6.根據權利要求1所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述陽性質控品中含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的擴增基因序列的質粒；根據權利要求1所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，采用無RNase水作為陰性對照。

7.根據權利要求1-5任一項所述的用于檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑的制備方法：使用標準脫鹽方法純化引物以滿足用于qPCR /RT-qPCR；采用HPLC或PAGE純化可能有助于需要的分析靈敏度提高。