[發(fā)明專利]一種非抗體依賴的蛋白質(zhì)甲基化修飾富集分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811397614.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111208244A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;孫明偉;梁振;單亦初;趙寶鋒;楊開(kāi)廣;張玉奎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/08
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種非抗體依賴的蛋白質(zhì)甲基化修飾富集分析方法，包括：甲基化修飾的樣品的Lys-C/Trypsin/Arg-C分別連續(xù)酶切；肽段N端氨基的固定；甲基化修飾肽段選擇性釋放及分離；LC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)解析甲基化修飾位點(diǎn)信息。

2.按照權(quán)利要求1的分析方法，其特征在于：連續(xù)酶切過(guò)程為，采用Lys-C(胞內(nèi)蛋白酶)、Trypsin(胰蛋白酶)、Arg-C(梭菌蛋白酶)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行連續(xù)酶切，通過(guò)降低無(wú)甲基化修飾賴氨酸和精氨酸的漏切，從而降低無(wú)甲基化修飾肽段對(duì)甲基化修飾肽段的干擾。

3.按照權(quán)利要求1的分析方法，其特征在于：酶切肽段N端氨基的固定過(guò)程為，采用氨基活性試劑與肽段N端的α-氨基反應(yīng)，將肽段固定在固相載體或者高分子材料上。

4.按照權(quán)利要求1的分析方法，其特征在于：甲基化修飾肽段選擇性的從材料上釋放及分離過(guò)程為，利用具有酶切甲基化修飾賴氨酸和精氨酸能力的酶對(duì)固定的肽段進(jìn)行酶切，可以實(shí)現(xiàn)固定肽段中的甲基化修飾的賴氨酸和精氨酸N端肽鍵水解，從而將甲基化修飾的肽段從材料上釋放，根據(jù)材料的特性，利用親和色譜或者分子篩將甲基化修飾的肽段與材料進(jìn)行分離，從而實(shí)現(xiàn)甲基化修飾肽段的選擇性富集。

5.按照權(quán)利要求1的分析方法，其特征在于：LC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)解析甲基化修飾位點(diǎn)信息過(guò)程為，利用LC對(duì)肽段進(jìn)行分離，利用ESI電離方式對(duì)分離的肽段進(jìn)行離子化，通過(guò)高分辨率質(zhì)譜分析離子化的肽段一級(jí)譜和二級(jí)譜，并利用搜索軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，從而鑒定出甲基化修飾肽段的信息。

6.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用Lys-C/Trypsin/Arg-C對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，三種蛋白水解酶用量為蛋白質(zhì)質(zhì)量的分別為1/5-1/500，在20-50℃酶解2-48h。

7.按照權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：

1)氨基反應(yīng)活性材料包括N-羥基琥珀酰亞胺酯活性瓊脂糖、溴化氰活性瓊脂糖、異氰酸樹(shù)脂、醛基功能化材料等中的一種或二種以上，調(diào)節(jié)pH為3-12，20-65度10min至24h；

2)氨基活性材料上多余活性基團(tuán)的終止：含有自由氨基的試劑都可以作為終止劑使用，可以是氨水、碳酸氫銨、乙醇胺、Tris-Cl等含有自由氨基的試劑中的一種或二種以上，試劑于體系中使用濃度為1mM-1000mM，20-70度反應(yīng)5min至4h；

3)純化含有固定肽段的材料：根據(jù)材料的性質(zhì)，可以使用離心、親和色譜、分子篩等方法中的一種或二種以上去除多余試劑以及沒(méi)有被固定的肽段，得到還有固定化肽段修飾的材料。

8.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于：

1)目前已有Lysarginase、Trypsin-N等具有酶切甲基化修飾賴氨酸和精氨酸能力，蛋白水解酶用量為蛋白質(zhì)質(zhì)量的1/5-1/500，在20-50℃酶解2-48h；

2)利用親和色譜分離甲基化修飾肽段，包括反相色譜、親水相互作用色譜，陰離子交換色譜或陽(yáng)離子交換色譜等中的一種或二種以上；

3)利用分子篩原理分離甲基化修飾肽段，包括使用濾膜、凝膠色譜等中的一種或二種以上。

9.按照權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于：

1)ESI質(zhì)譜儀為Orbitrap或者TOF為質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀；

2)對(duì)甲基化進(jìn)行數(shù)據(jù)解析的搜索軟件可以是基于數(shù)據(jù)庫(kù)的軟件，或也可以是基于從頭測(cè)序的軟件，目前可用的軟件有Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST，PEAKS等數(shù)據(jù)處理軟件中的一種或二種以上。

10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其可應(yīng)用的生物樣品包括細(xì)胞、組織、體液中的一種或二種以上。