[發(fā)明專利]一種提高魚鱗明膠品性的方法

有效

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• 申請日: 2018-11-22
• 公開（公告）號: CN109504665B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設計）人: 陳雪嵐;涂宗財;李雙;黃明珠
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12P21/00;C07K14/78
• 代理公司: 南昌華成聯(lián)合知識產權代理事務所(普通合伙) 36126
• 代理人: 張建新

本發(fā)明公開了一種提高魚鱗明膠品性的方法。在大腸桿菌中高效表達脯氨酸羥基化酶(L?proline cis?4?hydroxylase，P4H)并將其用于魚鱗明膠改性，從而提高明膠的品性以擴大其在市場的應用范圍。

技術領域

本發(fā)明涉及利用基因工程技術高效表達脯氨酸羥基化酶(L-proline cis-4-hydroxylase，P4H)并利用其對來源于魚鱗的明膠進行改性，從而提高其品性的方法。

背景技術

食用明膠(gelatin)是膠原的水解產物，是一種無脂肪的高蛋白，不含膽固醇，且是一種天然營養(yǎng)型食品增稠劑。明膠作為一種強有力的保護膠體，具有較強的乳化力，能有效抑制牛奶、豆?jié){等蛋白質進入胃后因胃酸作用而引起的凝聚反應，有利于提高食物消化能力。明膠除了在食品領域具有廣泛應用外，在醫(yī)藥、化妝品、照相等領域亦發(fā)揮著其特殊的功能。目前，工業(yè)上應用的明膠大部分來源于哺乳動物，如豬皮、牛皮、豬骨、牛骨等。但近年瘋牛病和口蹄病等哺乳動物傳染疾病的肆意傳播，導致哺乳動物明膠的安全性受到廣大消費者的普遍質疑；另因宗教信仰等原因使得哺乳動物明膠在某些食品中的應用亦受到一定限制。因此開發(fā)非哺乳動物來源的明膠具有重要的現(xiàn)實意義。

我國是淡水水產品養(yǎng)殖大國，淡水水產品產量居世界第一。隨著直接食用和加工量的不斷增加，淡水水產品消耗量呈現(xiàn)逐年增長趨勢，為提高水產品的附加值，尤其是提高廢棄魚鱗的再利用，開發(fā)來源于非哺乳動物的明膠以滿足社會需求的研究受到越來越多的科技工作者關注。但與哺乳動物來源的明膠相比，魚鱗明膠(scale gelatin,SG)由于亞氨基酸—羥脯氨酸含量相對偏低，使其明膠沒有足夠的羥基與水形成氫鍵來穩(wěn)定明膠的三聯(lián)體螺旋結構，導致明膠膠融溫度及強度等品性不及哺乳動物明膠。

發(fā)明內容

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于高效表達P4H并利用其對水產品來源的明膠進行改性，使魚鱗明膠品性得到提升。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下。

一種提高魚鱗明膠品性的方法，包括以下步驟：

(1)將含有P4H編碼基因的微生物的DAN序列除去終止密碼子；

(2)在除去了終止密碼子的P4H編碼基因的兩端分別加上限制性酶切位點；

(3)以表達質粒作為載體，采用限制性內切酶將P4H的編碼基因及載體進行消化產生互補的粘性末端，再在連接酶的作用下連接起來構建重組質粒；

(4)將重組質粒轉入感受態(tài)宿主中，篩選陽性克隆子，進行誘導高效表達P4H；

(5)分離純化P4H；

(6)將魚鱗明膠溶解于緩沖液中，加入純化的P4H，并加入所需的其他物質，混勻并在一定溫度下反應一段時間，然后滅活，得到改性的魚鱗明膠。

所述魚鱗明膠是由水產品廢棄物魚鱗加工而成的明膠；魚鱗可以來自淡水魚，也可來自海魚。

在步驟(1)中，含有P4H編碼基因的微生物是熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

在步驟(2)中，限制性酶切位點可以是XhoI和EcoRI限制性酶切位點。

在步驟(3)中，可以選擇pET-28(a)等質粒作為表達載體。

在步驟(4)中，可以通過熱激方法將重組質粒轉入感受態(tài)宿主大腸桿菌(Escherichia coli)或E.coli–Roestta中，采用抗性、菌落PCR篩選陽性克隆子。

在步驟(5)中，可以采用Ni柱進行親和層析純化。