[發(fā)明專利]一種擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811394334.6
• 申請(qǐng)日: 2018-11-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109355246B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史勇;金維環(huán);陳彥惠;任真真;劉姣姣;王林會(huì)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;C12N15/82;C12N5/10
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司 41109
• 代理人: 趙磊;王文文

本發(fā)明公開(kāi)了一種擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備方法，具體步驟如下：剪取3?5周的擬南芥葉片用無(wú)彈性的紙質(zhì)膠帶或布質(zhì)膠帶固定葉片的上表皮和下表皮；輕輕撕掉葉片下表皮的無(wú)彈性的紙質(zhì)膠帶或布質(zhì)膠帶，將剪好的葉片放入含有酶解液的培養(yǎng)皿中；將放有葉片的培養(yǎng)皿置于搖床中培養(yǎng)30?90min或者直至絕大部分或全部原生質(zhì)體從葉片上脫離下來(lái)為止；將含有原生質(zhì)體的酶解液轉(zhuǎn)移到圓底離心管中，離心收集原生質(zhì)體；用預(yù)冷的W5溶液清洗原生質(zhì)體，用W5溶液重懸原生質(zhì)體并在冰上放置最少30分鐘。本發(fā)明將原生質(zhì)體置于黑暗條件下培養(yǎng)，有效解決了光照培養(yǎng)引起的細(xì)胞死亡和凝聚現(xiàn)象，能極大的提高轉(zhuǎn)化效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物原生質(zhì)體是指去掉細(xì)胞壁但仍然保持活力的細(xì)胞團(tuán)。由于缺少細(xì)胞壁的保護(hù)和支撐作用，原生質(zhì)體可以吸收微生物、細(xì)胞器和核酸等大分子物質(zhì)，這使它成為一種基礎(chǔ)理論研究中重要的多用途細(xì)胞體系，在植物病毒、植物生理和作物育種研究上都有應(yīng)用。從不同組織和植株分離的原生質(zhì)體保留了原來(lái)的生理活性和調(diào)節(jié)功能，代謝方式和生理環(huán)境更接近細(xì)胞在整株植株上的狀態(tài)，提供了比細(xì)菌、酵母菌、昆蟲(chóng)和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞更好的細(xì)胞體系用于植物研究，是細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分化與分裂、胚胎形成、細(xì)胞器攝入、病毒侵染、生物與非生物脅迫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜透性及離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白亞細(xì)胞定位、基因功能驗(yàn)證等研究的良好材料，隨著基因組、蛋白組和代謝組學(xué)的發(fā)展，原生質(zhì)體在基礎(chǔ)研究上的用途還在不斷擴(kuò)展。

原生質(zhì)體的制備效率受植物類型、器官差異、材料的預(yù)處理與否及處理方式、材料的年齡、酶解溫度、震蕩的方式和強(qiáng)度、滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度、離子的類型和PH等的影響。目前，擬南芥和煙草葉片原生質(zhì)體的制備方法比較成熟，禾本科植物的原生質(zhì)體制備方法相對(duì)滯后但是也日趨完善。制備原生質(zhì)體的材料一般選取代謝活躍的組織或器官，如幼莖、葉鞘、葉片、根尖、根毛、子葉、胚軸、莖尖、愈傷組織、體細(xì)胞胚等。最近，Chen等又建立了玉米珠心原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化體系，并將珠心原生質(zhì)體用于細(xì)胞程序性死亡的研究。

目前，擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體應(yīng)用最廣泛，其主要用于蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、蛋白活性檢測(cè)、蛋白互作、基因調(diào)節(jié)，光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究中。擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體之所以能廣泛應(yīng)用的原因有：1）相對(duì)其他器官，葉片產(chǎn)量豐富；2）與未分化的懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體相比，葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體保留了大部分葉部細(xì)胞的特點(diǎn)；3）植株生長(zhǎng)和原生質(zhì)體短期培養(yǎng)不需要無(wú)菌的環(huán)境；4）不需要培養(yǎng)懸浮細(xì)胞等耗時(shí)的操作。

傳統(tǒng)擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備方法相對(duì)比較成熟，但是也有一定缺陷。例如：1）原生質(zhì)體的制備效率和轉(zhuǎn)化效率受植株生長(zhǎng)環(huán)境的影響，所以要嚴(yán)格控制植株的生長(zhǎng)環(huán)境。短日照和弱光環(huán)境能提高原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化效率；2）原生質(zhì)體的制備過(guò)程需要將擬南芥葉片切成0.5-2mm的條狀，切口處的細(xì)胞很容易被破壞，且在細(xì)胞壁酶解過(guò)程中需要真空處理，進(jìn)一步加大了對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷；3）需要4-5個(gè)小時(shí)才能得到可供轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，耗時(shí)長(zhǎng)。為此，Wu等人改進(jìn)了傳統(tǒng)的擬南芥原生質(zhì)體制備方法，用Tape-Arabidopsis Sandwich 方法（在此稱為“膠帶法”）極大的提高了擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備效率。但是膠帶法制備及轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體在實(shí)驗(yàn)耗材的準(zhǔn)備、原生質(zhì)體制備的時(shí)間、轉(zhuǎn)化過(guò)程都可以進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)，特別是Wu等人的方法存在光照培養(yǎng)條件容易造成細(xì)胞體死亡和凝聚，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化操作很難大批量操作等缺陷。

傳統(tǒng)的擬南芥原生質(zhì)體制備方法對(duì)擬南芥材料的生長(zhǎng)環(huán)境、植株年齡、生理狀態(tài)有較高的要求，制備過(guò)程要對(duì)葉片進(jìn)行切割和真空處理，對(duì)葉肉細(xì)胞造成很大的物理傷害，整個(gè)過(guò)程需要4-6個(gè)小時(shí)。Wu等人發(fā)明了一種新的方法-膠帶法制備擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，該方法不受植株年齡、生長(zhǎng)環(huán)境、生理狀態(tài)等的限制，同時(shí)新的方法不需要對(duì)葉片進(jìn)行切割和真空處理，減少了葉肉細(xì)胞的機(jī)械損傷，細(xì)胞組織碎片少，省去了酶解后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾的步驟。更重要的是膠帶法可以在1個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成原生質(zhì)體的制備，與傳統(tǒng)方法4-6個(gè)小時(shí)相比，極大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。但是Wu等人的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化方法也存在著缺陷，如原生質(zhì)體在光照培養(yǎng)培養(yǎng)條件容易死亡和凝聚，轉(zhuǎn)化效率低以及難大批量操作等。