[發明專利]一種擬南芥葉肉細胞原生質體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811394334.6
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109355246B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 史勇;金維環;陳彥惠;任真真;劉姣姣;王林會
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;C12N5/10
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 趙磊;王文文

1.擬南芥葉肉細胞原生質體在將外源基因轉入該擬南芥葉肉細胞原生質體進行表達的應用，其特征在于：具體步驟如下：

（一）擬南芥葉肉細胞原生質體的制備，

（1）剪取3-5周的擬南芥葉片用無彈性的紙質膠帶或布質膠帶固定葉片的上表皮和下表皮；

（2）輕輕撕掉葉片下表皮的無彈性的紙質膠帶或布質膠帶，用剪刀減掉下表皮未被撕掉的葉片部分和不含葉片的膠帶部分，將剪好的葉片放入含有酶解液的培養皿中；所述酶解液的配方為：1% cellulase R10，0.25% macerozyme R10，0.4mol/L 甘露醇，20 mmol/LKCl，20 mmol/L MES，10 mmol/L CaCl₂，0.1% BSA，pH=5.7；

（3）將放有葉片的培養皿置于35-45轉每分鐘的搖床中培養30-90min或者直至絕大部分或全部原生質體從葉片上脫離下來為止；

（4）將含有原生質體的酶解液轉移到圓底離心管中，90-110 xg離心2-4分鐘收集原生質體；用預冷的W5溶液清洗原生質體2次，用W5溶液重懸原生質體并在冰上放置最少30分鐘；所述W5溶液的配方為：154 mmol/L NaCl，125 mmol/LCaCl₂，5mmol/L KCl，2 mmol/LMES，5mmol/L葡萄糖，pH=5.7；

（二）外源基因轉入該擬南芥葉肉細胞原生質體進行表達

（1）將擬南芥葉肉細胞原生質體 90-110xg 條件下離心 1-2 分鐘，棄掉上清， 用新配制的MMg溶液重懸并將濃度調整到3 x10⁵-5x10⁵個細胞/ml；

（2）將載有目的基因的質粒加入到離心管底部，然后加入步驟（1）所得的MMg溶液，使質粒與原生質體充分混勻，質粒與原生質體的質量個數比為5μg-10μg質粒/5x10⁴個原生質體；

（3）加入等體積新配制的PEG4000溶液，反轉離心管使原生質體懸液與PEG4000溶液混合均勻，在室溫下放置8-30分鐘；

（4）90-110xg條件下離心1-2分鐘，收集原生質體，轉化后的原生質體用W5溶液漂洗；

（5）用W5溶液重懸原生質體并轉移到24孔板上，于黑暗條件下 、20-23℃培養14-18h，然后檢測目的基因是否表達，并確定表達產物的亞細胞定位情況。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述步驟（5）中，24孔板孔用0.5-0.8ml 1%的BSA溶液浸泡至少30分鐘，然后倒掉BSA溶液。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述MMg溶液的配方為：0.4 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl₂，4 mmol/L MES，pH=5.7。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述PEG4000溶液的配方為：40% PEG4000（m/v），0.2 mol/L甘露醇，0.1 mol/L CaCl₂。