[發明專利]一種新型賴氨酸特異性內切酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201811394022.5
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109439643B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 賴紅星;馬文柱;夏玉平;姚元鋒;雷春紅;肖擁軍;羅湘冀
• 申請（專利權）人: 珠海冀百康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 陳慧華

本發明公開了一種新型賴氨酸特異性內切酶，通過合適的柔性連接肽連接酶核心肽和組氨酸標簽，使其既能通過ELISA方法檢測樣品中納克級殘留的酶，又保證具有野生型賴氨酸特異性內切酶全酶活性。同時，本發明還提供了該酶的一種制備方法，通過基因工程改造和發酵工藝的優化，使其具有高產量的有益效果，1L發酵液經純化后可達到857mg新型賴氨酸特異性內切酶純品的回收量，具有工業化的潛力。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種新的賴氨酸特異性內切酶及其制備方法。

背景技術

賴氨酸特異性內切酶(Lysyl endopeptidase,EC 3.4.21.50)又稱賴氨酰肽鏈內切酶、無色桿菌蛋白酶I、賴氨酸內肽酶、賴氨酰內切酶、賴氨酸C端內切酶、Lys-C內切酶，是一種絲氨酸蛋白酶，最初由Masaki等人從土壤細菌中發現并分離得到的。賴氨酸特異性內切酶具有高度特異性，可特異性切割肽鏈中賴氨酸殘基和S-氨乙基半胱氨酸殘基羧基端的肽鍵。

賴氨酸特異性內切酶還具有以下顯著特點：1)比牛胰蛋白酶的活性高10倍；2)具有廣泛的pH耐受性(pH8.5-10.5)；3)更強的表面活性劑耐受性，如在含4mol/L尿素或0.1％SDS的溶液中保持全酶活性；4)比胰蛋白酶具有更高的底物特異性，胰蛋白酶可以識別和切割賴氨酸和精氨酸，而賴氨酸特異性內切酶通常只識別和切割賴氨酸，因此能顯著提高酶切轉化率和產物純度。由于這些特點，賴氨酸特異性內切酶在蛋白序列分析(如質譜分析)、蛋白組學研究(如肽圖譜分析)和生物制藥(如胰島素原的酶切)、Lys-X化合物酶催化合成等領域具有重要應用價值。

而目前所使用的賴氨酸特異性內切酶存在著以下的問題和缺點：

1.利用野生菌表達賴氨酸特異性內切酶時表達水平太低，無法滿足工業化需求。雖然使用野生經誘變選育得到的突變菌株在一定程度上提高表達水平，但是突變菌株穩定性不高，存在回復突變的風險。CN103865836A“一株產酶溶桿菌突變菌株及其制備方法”中公開了一株通過自然選育得到產酶溶桿菌菌株L.enzymogens PGJZC30后再經太空誘變育種得到的表達量最高的突變菌株L.enzymogens TGJZC-041。該菌株使用50L發酵罐發酵培養3天，表達量為1.3U/mL，經純化后獲得390mg的Lys-C，即產量為7.8mg/L。

2.為了克服野生菌表達水平低的缺點，人們使用大腸桿菌等工程菌株制備重組賴氨酸特異性內切酶，但是產量沒有明顯提高，重組賴氨酸特異性內切酶的比活反而有所降低。US5248599A和EP0387646B1公布了一種使用重組大腸桿菌制備賴氨酸特異性內切酶的方法。該方法使用大腸桿菌表達賴氨酸特異性內切酶酶原，并利用大腸桿菌自身修飾加工系統使酶原自我激活，形成具有活性的成熟酶，1L發酵液可獲得1.6mg的重組賴氨酸特異性內切酶純品。CN105950593A“一種賴氨酸特異性內切酶的原核重組表達與制備方法”公布了一種利用大腸桿菌制備重組賴氨酸特異性內切酶的方法。該方法使用重組大腸桿菌表達重組賴氨酸特異性內切酶酶原，產物以包涵體形式存在，經過變性、復性、激活、硫酸銨沉淀、親和層析、超濾和過凝膠過濾層析獲得重組賴氨酸特異性內切酶純品。每1L發酵體系獲得的包涵體經變性可獲得1888mg的酶原，經純化可獲得36.61mg的重組賴氨酸特異性內切酶純品，回收率為1.9％。

3.在生物制藥領域使用傳統的賴氨酰特異性內切酶時，無法使用高靈敏方法檢測藥物中賴氨酸特異性內切酶的殘留量。采用高效液相色譜法檢測中間體以及原料藥中賴氨酸特異性內切酶殘留量，其檢測限只能達到μg級別，且不能檢測到賴氨酸特異性內切酶自身降解條帶；蛋白電泳法能檢測到賴氨酸特異性內切酶自身降解條帶，但檢測限也只能達到μg級別；賴氨酸特異性內切酶ELISA檢測試劑盒開發成本高，且目前尚無商業化的ELISA試劑盒可以用于檢測賴氨酸內肽酶的殘留。

因而，開發一種新型的賴氨酸特異性內切酶是非常有必要的。

發明內容