[發明專利]一種用于檢測慢病毒RCL的引物、探針及檢測方法

在審

• 申請號: 201811392904.8
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109295261A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳必成;凌發忠
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京康思博達知識產權代理事務所(普通合伙) 11426
• 代理人: 范國鋒;路永斌

本發明公開了一種用于慢病毒RCL檢測的引物對、探針、試劑盒及其檢測方法，所述引物對的序列分別包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述探針序列為如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本發明所提供的引物對和探針序列，特異性強，靈敏度和重復性高，所述檢測方法檢測周期短，檢測精度高，可檢測出的樣本濃度下限低。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測慢病毒RCL的引物、探針及檢測方法。

背景技術

慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體，其是目前應用最廣泛的基因運載工具之一，在基因治療研究和轉基因動物的制備中已顯示出其廣闊的應用前景。但是，操作慢病毒載體仍有一些隱患，主要在于：(a)可能產生自我復制的有感染能力的慢病毒(RCL)；(b)腫瘤生成的潛在可能性；(c)轉基因的潛在毒性。

為了改善慢病毒的生物安全，人們做出了很大的努力。其中，針對主要可獲得的商品化慢病毒系統——第二和第三代慢病毒系統，采取了很多安全措施以降低風險。主要包括：通過去除輔助基因減少或消除HIV-1致病性；通過包裝蛋白和酶用不同的載體表達來減少包裝構建體之間的同源性，以降低同源重組的可能性。此外，由于剔除了3'LTR，慢病毒自身是無活性的，以上措施的施用減少了病毒同源重組和動員整合載體的可能性。

隨著慢病毒在基因治療和細胞治療中的應用，慢病毒載體在醫學中顯示出了希望。然而，由于插入突變有產生有復制能力病毒的潛在風險，慢病毒載體的安全性和遺傳毒性已成為阻礙其用于治療的主要原因。Paul Escarpe等人使用VSV Gag基因表型假型病毒作為慢病毒RCL的標準來進行檢測，該方法通過將載體樣品在細胞系C8166-45暴露于7天以增加RCL感染和擴增的機會，然后將培養物定期稀釋六次以允許RCL擴增，每次收集培養上清液樣品，通過測量p24衣殼蛋白濃度來分析病毒的復制情況。此方法操作繁瑣復雜，檢測周期過長，且不能快速檢測出慢病毒RCL。

因此，提供一種操作簡單、檢測周期短且靈敏度高的慢病毒RCL檢測方法是目前亟需解決的問題。

發明內容

為了克服上述問題，本發明人進行了銳意研究，針對VSV Gag基因設計了用于檢測慢病毒RCL的一對特異性引物和探針，并結合標準陽性質粒，通過熒光定量PCR方法能對慢病毒進行快速、準確的檢測，從而完成了本發明。

具體來說，本發明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供了一種用于檢測慢病毒RCL的引物對，其中，所述引物對包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

第二方面，提供了一種用于檢測慢病毒RCL的探針，其中，所述探針序列為如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

第三方面，提供了一種用于檢測慢病毒RCL的試劑盒，其中，所述試劑盒包括第一方面所述的引物對和第二方面所述的探針。

其中，所述試劑盒還包括標準陽性質粒、PCR反應體系和酶體系。

其中，所述標準陽性質粒的制備方法包括以下步驟：

步驟i，獲取慢病毒RCL的靶序列片段；

步驟ii，構建包含上述靶序列片段的重組質粒；

步驟iii，測定重組質粒的濃度，并計算相應拷貝數，得到標準陽性質粒。

其中，所述PCR反應體系包括緩沖液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶體系包括反轉錄酶和熱啟動DNA聚合酶。

其中，步驟i包括以下子步驟：