[發明專利]用于檢測熱休克蛋白70(HSP70)的磁微粒分離化學發光免疫測定法

在審

• 申請號: 201811392775.2
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109613255A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 郭健夫;桂穎;王義君
• 申請（專利權）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/535;G01N33/58;G01N21/76
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍

1.人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，試劑盒組成包括：校準品、質控品試劑A、試劑B、清洗液濃縮液、發光底物液，其中，校準品為含一系列濃度的熱休克蛋白70(HSP70)抗原，用于建立標準曲線；質控品為含一定濃度熱休克蛋白70(HSP70)抗原的緩沖液配制而成；試劑A為含一定濃度磁微粒標記的熱休克蛋白70(HSP70)抗體溶液；試劑B為含一定濃度堿性磷酸酶標記的熱休克蛋白70(HSP70)抗體溶液；清洗液濃縮液用于配制清洗液；發光底物液為堿性磷酸酶(ALP)催化的發光底物溶液；檢測方法包括：

(1)免疫反應：將待測樣品與質控品、50μl試劑A、50μl試劑B依次加入反應管中，37℃條件下混合溫育15min；

(2)磁分離：使磁微粒在磁場中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁場，然后再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清液；如此重復2-4次，以去除未結合的抗體和雜質；

(3)讀值：加入發光底物液150μl，堿性磷酸酶(ALP)催化底物發光后采用利德曼自研化學發光檢測儀測定相對發光強度(RLU)；

(4)算出含量：將待測樣本的發光強度與校準品的標準曲線比對，使用四參數Logistic方程擬合可計算出待測樣本中熱休克蛋白70(HSP70)的含量。

2.根據權利要求1所述人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，所述試劑A的配置方法包括：將表面含有羧基(COOH-)活性基團的磁微粒進行磁分離，然后用活化緩沖液清洗3次；混懸后加入活化劑，活化后的磁微粒溶液與熱休克蛋白70(HSP70)抗體按比例混合，使得熱休克蛋白70(HSP70)抗體被共價偶聯在磁微粒表面。

3.根據權利要求2人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，所述活化緩沖液為摩爾濃度0.05M的(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)MES，pH6.0，所述活化劑為1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)。

4.根據權利要求2人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，所述比例為20：1。

5.根據權利要求1人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，所述試劑B的配置方法包括：熱休克蛋白70(HSP70)抗體、堿性磷酸酶(ALP)分別加入活化劑，除鹽；活化后的熱休克蛋白70(HSP70)抗體、堿性磷酸酶(ALP)按比例混合；分離純化，除去未連接的熱休克蛋白70(HSP70)抗體和堿性磷酸酶(ALP)，將連接物保存于4℃。

6.根據權利要求5人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，熱休克蛋白70(HSP70)抗體加入的活化劑為2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT)，堿性磷酸酶(ALP)加入的活化劑為Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)。

7.根據權利要求5人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，所述比例為1：1。

8.根據權利要求5人體熱休克蛋白70(HSP70)磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特征在于，所述除鹽為使用Sephadex G25凝膠柱子除鹽，所述分離純化為使用Supperdex200凝膠層析柱分離純化。