[發(fā)明專利]一種賴氨酸氮連接磷酸化翻譯后修飾富集和鑒定的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811389998.3
• 申請(qǐng)日: 2018-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN111208300B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;胡曄晨;江波;李洋;高航;梁振;楊開廣;張玉奎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N30/89
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及一種賴氨酸氮連接的磷酸化翻譯后修飾富集和鑒定方法。通過賴氨酸氮連接磷酸化肽段上磷酸基團(tuán)丟失后產(chǎn)生新的仲胺與疏水衍生化試劑反應(yīng)，并通過疏水相互作用對(duì)賴氨酸磷酸化肽段實(shí)現(xiàn)特異性富集，進(jìn)而通過質(zhì)譜分析獲得鑒定。通過該方法，實(shí)現(xiàn)賴氨酸氮連接磷酸化翻譯后修飾位點(diǎn)的大規(guī)模富集和鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，具體的說，是通過化學(xué)衍生標(biāo)記和特異性富集實(shí)現(xiàn)賴氨酸氮連接磷酸化翻譯后修飾的富集和鑒定。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)的磷酸化翻譯后修飾是最常見、最重要的一種翻譯后修飾之一，幾乎參與了生命過程中的每個(gè)環(huán)節(jié)，研究報(bào)道其對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及生物體中的信號(hào)傳導(dǎo)起著重要的作用。近些年來，在大規(guī)模的磷酸化翻譯后修飾的研究中，高效的磷酸化蛋白/磷酸化肽富集技術(shù)結(jié)合多維色譜分離技術(shù)以及高分辨的質(zhì)譜的應(yīng)用，極大的增強(qiáng)了磷酸化翻譯后修飾的動(dòng)態(tài)范圍和檢測(cè)限，越來越多的磷酸化位點(diǎn)和磷酸化蛋白被檢測(cè)出來了。然而，這些磷酸化翻譯后修飾主要包括絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸在內(nèi)的氧連接的磷酸化修飾，而對(duì)于另一類磷酸化修飾——氮連接的磷酸化翻譯后修飾，其豐度和生物學(xué)功能的研究卻少有報(bào)道。

不同于氧連接磷酸化氨基酸，賴氨酸氮連接磷酸化具有不同的化學(xué)性質(zhì)——在酸性條件下極不穩(wěn)定，因此在傳統(tǒng)的研究方法中容易發(fā)生水解而去磷酸化，因此目前為止尚無針對(duì)賴氨酸磷酸化富集和鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道。僅有少數(shù)文獻(xiàn)研究了賴氨酸氮連接磷酸化肽的合成方法(Jordi Bertran-Vicente,Journal of the American Chemical Society,2014,136,13622-13628)及其在質(zhì)譜中的碎裂規(guī)則(Jordi Bertran-Vicente,AnalyticalChemistry,2015,6990-6994)。隨著現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)氮連接磷酸化翻譯后的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，本領(lǐng)域也因此開始迅速發(fā)展。基于此，我們提出了一種通過化學(xué)衍生標(biāo)記和特異性富集技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了賴氨酸氮連接磷酸化翻譯后修飾的富集和大規(guī)模鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

通過賴氨酸氮連接磷酸化肽段上磷酸基團(tuán)丟失后產(chǎn)生新的仲胺與疏水衍生化試劑反應(yīng)，并通過疏水相互作用對(duì)賴氨酸磷酸化肽段實(shí)現(xiàn)特異性富集，進(jìn)而通過質(zhì)譜分析獲得鑒定。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案步驟如下：

步驟1)首先對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物中的賴氨酸進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記；

步驟2)對(duì)于步驟(1)中化學(xué)標(biāo)記的蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行去除賴氨酸上磷酸基團(tuán)的操作；

步驟3)對(duì)步驟(2)中除去磷酸基團(tuán)的蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行可斷裂的疏水化衍生；

步驟4)對(duì)步驟(3)中疏水化衍生的肽段進(jìn)行特異性富集；

步驟5)對(duì)步驟(4)中富集到的肽段進(jìn)行去疏水鏈斷裂，最后對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

所述的蛋白酶解、化學(xué)標(biāo)記、除去磷酸基團(tuán)、可斷裂的疏水化衍生、特異性富集和去疏水鏈斷裂詳細(xì)說明如下：

(1)蛋白酶解：將蛋白進(jìn)行變性還原烷基化后，利用蛋白酶，如胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶中的一種或二種以上，37℃條件下對(duì)蛋白進(jìn)行酶解1-24h；所述蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白或標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物、細(xì)胞或組織中提取的全蛋白或部分蛋白。