[發明專利]一種賴氨酸氮連接磷酸化翻譯后修飾富集和鑒定的方法

有效

• 申請號: 201811389998.3
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN111208300B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 張麗華;胡曄晨;江波;李洋;高航;梁振;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種賴氨酸氮連接的磷酸化翻譯后修飾肽段的富集和鑒定方法，其特征在于：

步驟（ 1）對蛋白酶解產物中的賴氨酸進行化學標記；

步驟（ 2）對于步驟（1）中化學標記的蛋白酶解產物進行去除賴氨酸上磷酸基團的操作；

步驟（ 3）對步驟（2）中除去磷酸基團的蛋白酶解產物進行可斷裂的疏水化衍生；

步驟（ 4）對步驟（3）中疏水化衍生的肽段進行特異性富集；

步驟（ 5）對步驟（4）中富集到的肽段進行去疏水鏈斷裂，最后對其進行質譜鑒定；

可斷裂的疏水化衍生的過程采用的可斷裂疏水化衍生化試劑是：能與肽段賴氨酸側鏈的α氨基發生高選擇性反應同時生成可斷裂疏水性化學標簽的分子。

2.按照權利要求1所述的富集和鑒定方法，其特征在于：蛋白酶解產物是胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及蛋白內切酶中的一種或二種以上對蛋白進行酶解后的產物。

3.按照權利要求1所述的富集和鑒定方法，其特征在于：化學標記的過程為，化學標記采用是能與肽段N端和賴氨酸側鏈的α氨基發生選擇性反應同時生成化學標簽的試劑中的一種或二種以上，該試劑包括酸酐類試劑：重量比0.01-100%的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一種或二種以上；羧基活化類試劑：重量比0.01-100%的N-羥基丁二酰亞胺、4-二甲氨基吡啶中的一種或二種以上；醛類試劑：重量比0.01-100%的甲醛、乙醛、丙醛中的一種或二種以上；以及氨基酸類試劑：0.01-1 M的精氨酸、賴氨酸、組氨酸中的一種或二種以上；

反應的緩沖體系為：pH 7-9，濃度為10-500 mM的磷酸緩沖液、pH 7-9，濃度為10-500mM的碳酸氫銨緩沖液、pH 6-10，濃度為10-500 mM的Tris-HCl緩沖液中的一種或二種以上。

4.按照權利要求1所述的富集和鑒定方法，其特征在于：除去磷酸基團的蛋白酶解產物的過程為，運用磷酸酶去除法和酸去除法中的一種或兩種；

所述磷酸酶去除法是采用一種或兩種賴氨酸磷酸酶去除賴氨酸上的磷酸基團的方法，磷酸酶包括堿性賴氨酸磷酸酶或酸性賴氨酸磷酸酶中的一種或兩種；

所述酸去除法是采用酸性物質去除賴氨酸上的磷酸基團的方法，酸性物質是pH大于或等于1.0，小于或等于4.0的液體物質，具體為質量比為0.1%-100%的鹽酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、三氯乙酸中的一種或二種以上。

5.按照權利要求1所述的富集和鑒定方法，其特征在于：可斷裂是指能夠在光照、酸性或化學條件下發生化學鍵斷裂的基團；

光照條件可斷裂基團包括硝基苯在100-1000 nm波長范圍內的照射下斷裂；

酸性條件可斷裂基團包括：席夫堿在pH 1-6的磷酸、鹽酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一種或二種以上水溶液中斷裂；

化學條件可斷裂基團包括：鄰二羥基在高碘酸鈉水溶液中斷裂和/或二硫鍵在二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦水溶液中斷裂。

6.按照權利要求1所述的富集和鑒定方法，其特征在于：

疏水化衍生是指通過化學反應使得肽段的疏水性增加;

疏水性化學標簽包括：長度為1-100個碳的脂肪族碳鏈、具有1-100個芳香環的芳香族化合物、以及由1-100個碳的脂肪碳鏈與1-100個芳香環組成的化合物中的一種或二種以上。

7.按照權利要求1所述的富集和鑒定方法，其特征在于：能與肽段賴氨酸側鏈的α氨基發生選擇性反應的基團包括下述中的一種或二種以上,

琥珀酰亞胺酯基團：重量比0.01-100%的琥珀酰亞胺酯；酸酐基團：重量比0.01-100%的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一種或二種以上；羧基活化基團：重量比0.01-100%的N-羥基丁二酰亞胺、4-二甲氨基吡啶中的一種或二種以上；醛基團：重量比0.01-100%的甲醛、乙醛、丙醛中的一種或二種以上；以及氨基酸基團：0.01-1M的精氨酸、賴氨酸、組氨酸中的一種或二種以上。