[發明專利]一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法

在審

• 申請號: 201811389990.7
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN111206064A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 張麗華;楊超;單亦初;楊開廣;吳瓊;張玉奎;梁振
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C12N11/02;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法及其應用，包括：肽酶的固定化；利用固定化酶反應器酶解多肽。首先將氨肽酶和羧肽酶分別制成固定化酶反應器，再利用固定化酶反應器從多肽的C端或者N端進行酶解，從而得到氨基酸序列連續的多肽酶解產物。本發明優點是：使用固定化酶反應器酶解效率高；使用該方法可獲得酶解后氨基酸序列連續的產物；方法所制得的固定化酶反應器易于保存，可重復使用。

技術領域

本發明涉及多肽的水解酶水解方法，即一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法，以實現獲得連續的肽酶酶解產物。

背景技術

對蛋白質的氨基酸序列的測定是蛋白質組學領域中的重要技術之一，蛋白質以及多肽測序的傳統方式主要是對DNA的序列分析和Edman降解測序。Edman降解是化學法對多肽進行末端水解，通過使多肽N末端與異硫氰酸苯酯反應，在酸性環境中可使N末端氨基酸脫落，從而達到逐個水解氨基酸的目的，通過液相色譜法檢測氨基酸種類，從而得到肽段N段的若干氨基酸序列。但此方法只能從多肽N端水解并且無法水解N末端被封閉的的多肽。除了化學法肽酶酶解法也可對多肽進行末端水解，是通過利用羧肽酶或氨肽酶與多肽反應，使多肽C末端或N末端的氨基酸殘基水解，通過質譜檢測酶解前后多肽的分離量差異，從而確定氨基酸種類，最終確定多肽C端和N段的氨基酸序列。但在自由溶液中進行肽酶水解，無法控制多肽的水解程度，水解產物氨基酸序列不具有連續性。

為克服以上方法存在的問題，我們選擇利用肽酶固定化酶反應器對多肽進行酶解，通過控制流速來改變多肽的酶解程度，以實現高效酶解并獲得氨基酸序列連續的酶解產物。

發明內容

本發明發展了一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法，酶解效率高，可獲得連續的酶解產物，可重復使用。

為了實現該目的，本發明的技術方案是：

一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法，包括：利用固定化羧肽酶反應器和固定化氨肽酶反應器酶解多肽。

所述的酶解方法，1)將肽酶固定在石英毛細管柱中；2)使用固定化羧肽酶和氨肽酶對多肽進行酶解。

所述的方法，1)將肽酶固定在石英毛細管柱中，其具體步驟如下：

將羧肽酶溶在pH 3-10的緩沖液中，羧肽酶終濃度為0.001-1mg/mL，得到溶液A，在溫度為4℃-10℃時向毛細管柱中通入溶液A，流速為0.01-20μL/min，通入時間為30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min沖洗100min，得到羧肽酶固定化酶反應器；

將氨肽酶溶在pH 3-10的緩沖液中，氨肽酶終濃度為0.001-1mg/mL，得到溶液A，在溫度為4℃-10℃時向毛細管柱中通入溶液A，流速為0.01-20μL/min，通入時間為30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min沖洗100min，得到氨肽酶固定化酶反應器；

2)使用固定化酶反應器對多肽進行酶解，其具體步驟如下：

將多肽溶解在pH 3-10的緩沖液中，多肽終濃度為0.001-1mg/mL，得到溶液B，將溶液B在離心并取其上清得到溶液C；

將溶液C先后分別通入羧肽酶固定化酶反應器和氨肽酶固定化酶反應器；

流速為0.01-20μL/min，通入時間為30-720min，反應溫度為20-90℃。

將溶液C先通入羧肽酶固定化酶反應器、后通入氨肽酶固定化酶反應器；或將溶液C先通入氨肽酶固定化酶反應器、后通入羧肽酶固定化酶反應器。

羧肽酶包括但不限于羧肽酶Y、羧肽酶A和羧肽酶B中的一種或兩種。

所述的石英毛細管柱包括但不限于開管柱、整體柱和填充柱中的一種或兩種以上。