[發明專利]一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法

在審

• 申請號: 201811389990.7
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN111206064A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 張麗華;楊超;單亦初;楊開廣;吳瓊;張玉奎;梁振
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C12N11/02;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種用于序列測定的基于固定化肽酶反應器酶解方法，其特征在于：包括利用固定化羧肽酶反應器和固定化氨肽酶反應器酶解多肽。

2.按照權利要求1所述的酶解方法，其特征在于：

1)將肽酶固定在石英毛細管柱中；

2)使用固定化羧肽酶和氨肽酶對多肽進行酶解。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：

1)將肽酶固定在石英毛細管柱中，其具體步驟如下：

將羧肽酶溶在pH 3-10的緩沖液中，羧肽酶終濃度為0.001-1mg/mL，得到溶液A，在溫度為4℃-10℃時向毛細管柱中通入溶液A，流速為0.01-20μL/min，通入時間為30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min沖洗100min，得到羧肽酶固定化酶反應器；

將氨肽酶溶在pH 3-10的緩沖液中，氨肽酶終濃度為0.001-1mg/mL，得到溶液A，在溫度為4℃-10℃時向毛細管柱中通入溶液A，流速為0.01-20μL/min，通入時間為30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min沖洗100min，得到氨肽酶固定化酶反應器；

2)使用固定化酶反應器對多肽進行酶解，其具體步驟如下：

將多肽溶解在pH 3-10的緩沖液中，多肽終濃度為0.001-1mg/mL，得到溶液B，將溶液B在離心并取其上清得到溶液C；

將溶液C先后分別通入羧肽酶固定化酶反應器和氨肽酶固定化酶反應器；

流速為0.01-20μL/min，通入時間為30-720min，反應溫度為20-90℃。

4.按照權利要求2或3所述的方法，其特征在于：將溶液C先通入羧肽酶固定化酶反應器、后通入氨肽酶固定化酶反應器；或將溶液C先通入氨肽酶固定化酶反應器、后通入羧肽酶固定化酶反應器。

5.按照權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：羧肽酶包括但不限于羧肽酶Y、羧肽酶A和羧肽酶B中的一種或兩種。

6.按照權利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述的石英毛細管柱包括但不限于開管柱、整體柱和填充柱中的一種或兩種以上。

7.按照權利要求1-6任一所述的方法，其可應用于生物樣品中蛋白水解酶水解底物或多肽，水解底物或多肽再酶解后序列的測定，生物樣品為細胞、組織、體液中的一種或二種以上；所述多肽為生物樣品中蛋白水解酶水解底物或多肽。

8.按照權利要求1-6任一所述的方法,可用于對藥物多肽或生物毒液中多肽酶解后的氨基酸序列測定。