[發(fā)明專利]體外檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN111198272B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬聰
• 申請（專利權(quán)）人: 香港理工大學(xué)深圳研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 高星

本發(fā)明提供了體外檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒及其應(yīng)用。在細(xì)胞外采用雙分子螢光互補(bǔ)技術(shù)進(jìn)行檢測，包括：S01、構(gòu)建第一重組質(zhì)粒，第一重組質(zhì)粒中包含第一檢測蛋白基因、螢光素酶基因片段和蛋白純化標(biāo)簽基因；然后，將第一重組質(zhì)粒載體進(jìn)行過表達(dá)，得到第一融合蛋白；第一融合蛋白中含第一檢測蛋白和螢光素酶蛋白片段；S02、構(gòu)建第二重組質(zhì)粒，第二重組質(zhì)粒中含第二檢測蛋白基因、螢光素酶互補(bǔ)基因片段和蛋白純化標(biāo)簽基因；將第二重組質(zhì)粒載體進(jìn)行過表達(dá)，得到第二融合蛋白；第二融合蛋白中含第二檢測蛋白和螢光素酶互補(bǔ)蛋白片段；S03、將第一融合蛋白和第二融合蛋白在細(xì)胞外孵育，加入螢光素酶底物，觀察是否發(fā)射螢光，并檢測發(fā)光強(qiáng)度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于活性藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及體外檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展，通過蛋白與蛋白間的相互作用在生物學(xué)上的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)出來，蛋白間的相互作用能影響細(xì)胞的活性，部分蛋白間的相互作用對生物體保持正常功能和狀態(tài)有著決定性的影響，甚至可用來解釋和預(yù)測各種生命過程及現(xiàn)象。近年來，通過檢測蛋白間的相互作用來輔助新藥研發(fā)，已經(jīng)成為相關(guān)研究工作者關(guān)注的焦點。

目前，對蛋白與蛋白間的相互作用的檢測與分析方法包括：酵母雙雜交系統(tǒng)、串聯(lián)親和純化技術(shù)、凝膠過濾層析、酶聯(lián)免疫吸附試驗、表面等離子體共振、等溫量熱滴定和螢光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)等，這些方法都能較好地檢測蛋白與蛋白間的相互作用。但這些方法或檢測時間較長，或需要昂貴的專用科學(xué)儀器，或需要購買較多的費(fèi)用不菲的材料。因而，一種簡單實用、高效靈敏且時間與費(fèi)用花費(fèi)較少的檢測方法是目前亟需的。

Promega公司開發(fā)了使用螢光素酶開發(fā)了一種產(chǎn)品NanoBiT，利用雙分子螢光互補(bǔ)系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白與蛋白間的相互作用，適用于多種生物學(xué)實驗。然而，目前的雙分子螢光互補(bǔ)系統(tǒng)均應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)檢測，其具體過程為：構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒A和B，重組質(zhì)粒A包含目標(biāo)檢測蛋白A基因和螢光素酶基因片段，重組質(zhì)粒B包含目標(biāo)檢測蛋白B基因和螢光素酶互補(bǔ)基因片段；然后，將這兩個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)用于表達(dá)融合蛋白；之后，加入螢光素酶底物后，通過觀察是否出現(xiàn)螢光來判斷目標(biāo)檢測蛋白A和目標(biāo)檢測蛋白B之間是否發(fā)生相互作用。由于在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行實驗，將上述雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)應(yīng)用于高通量篩選靶向蛋白間相互作用的活性分子時，存在多種局限性：需要孵育細(xì)胞，花費(fèi)時間長；在細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)，無法定量把控融合蛋白的表達(dá)效率；由于細(xì)胞膜的透膜率、外排泵的效率和代謝酶的水平不確定，活性分子和螢光素酶底物在細(xì)胞內(nèi)的濃度無法定量，導(dǎo)致較高的假陰性概率。因而，現(xiàn)有雙分子螢光互補(bǔ)系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白與蛋白間的相互作用，不適用于靶向蛋白間相互作用的活性分子的高通量篩選。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種體外檢測蛋白間相互作用的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的花費(fèi)時間長、假陰性概率高等技術(shù)問題。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測試劑盒，用于體外檢測蛋白間相互作用，旨在簡化操作過程，簡單實用、高效靈敏。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述體外檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒在高通量篩選靶向蛋白間相互作用的活性分子中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一方面，提供了一種體外檢測蛋白間相互作用的方法，在細(xì)胞外采用雙分子螢光互補(bǔ)技術(shù)進(jìn)行檢測，包括：

S01、構(gòu)建第一重組質(zhì)粒，所述第一重組質(zhì)粒中包含第一檢測蛋白基因、螢光素酶基因片段和蛋白純化標(biāo)簽基因；然后，將所述第一重組質(zhì)粒載體進(jìn)行過表達(dá)，純化，得到第一融合蛋白；

所述第一融合蛋白中含由所述第一檢測蛋白基因表達(dá)的第一檢測蛋白，以及由所述螢光素酶基因片段表達(dá)的螢光素酶蛋白片段；

S02、構(gòu)建第二重組質(zhì)粒，所述第二重組質(zhì)粒中包含第二檢測蛋白基因、螢光素酶互補(bǔ)基因片段和蛋白純化標(biāo)簽基因；然后，將所述第二重組質(zhì)粒載體進(jìn)行過表達(dá)，純化，得到第二融合蛋白；