[發明專利]體外檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201811388110.4
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN111198272B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 馬聰
• 申請（專利權）人: 香港理工大學深圳研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 高星

1.一種非疾病診斷目的的體外檢測蛋白間相互作用的方法，其特征在于，在細胞外采用雙分子螢光互補技術進行檢測，包括：

S01、構建第一重組質粒，所述第一重組質粒中包含第一檢測蛋白基因、螢光素酶基因片段和蛋白純化標簽基因；然后，將所述第一重組質粒載體進行過表達，純化，得到第一融合蛋白；

其中，構建第一重組質粒pCU231：bla?P_φ10-6×His-smBiT-nusB-T_φ的過程如下：

選擇pETMCSIII作為質粒載體，用于過表達N-端組氨酸標記的重組蛋白；

采用引物N?smbit_F和N?lg/smbit_R從質粒pBiT2.1-N?[TK/SmBiT]上擴增含螢光素酶基因片段smBiT的smBiT-linker片段；

使用NdeI-NcoI酶切，在pETMCSIII的NdeI-NcoI酶切位點上插入smBiT-linker片段，得到質粒載體pCU180；

采用引物smbit?nusB_F和smbit?nusB_R從質粒pNG130擴增枯草芽孢桿菌nusB基因，得到含第一檢測蛋白基因的nusB片段；使用EcoRI和Acc65I酶切，將nusB片段插入pCU180的EcoRI和Acc65I酶切位點位點上，得到含螢光素酶基因smBiT和第一檢測蛋白基因nusB的重組質粒載體pCU231；

所述第一融合蛋白中含所述第一檢測蛋白基因表達的第一檢測蛋白，以及所述螢光素酶基因片段表達的螢光素酶蛋白片段；

S02、構建第二重組質粒，所述第二重組質粒中包含第二檢測蛋白基因、螢光素酶互補基因片段和蛋白純化標簽基因；然后，將所述第二重組質粒載體進行過表達，純化，得到第二融合蛋白；

其中，構建質粒pCU235：bla?P_φ10-lgBiT-nusE-6×His-T_φ的過程如下：

選擇pNG209作為質粒載體，用于過表達C-端組氨酸標記的重組蛋白；

采用引物對C_hisoligo_1和C_hisoligo_2擴增寡聚核苷酸接頭片段，得到寡聚核苷酸接頭片段hisoligo；將pNG209的限制性內切酶NdeI-NcoI?片段進行酶切，在該酶切片段接上退火的寡聚核苷酸接頭片段hisoligo，得到pCU198；

采用引物N_lgbit?F和N_lg/smbit?R從質粒pBiT1.1-N[TK/LgBiT]上擴增含螢光素酶互補基因lgBiT的lgBiT-linker片段；在pCU198的NdeI-NcoI位點上插入lgBiT-linker片段，得到質粒載體pCU202；

取枯草芽孢桿菌nusE基因，采用引物N_nusE_F和N_nusE_R從載體pNG134進行擴增，得到含第二檢測蛋白基因的nusE片段；將nusE片段插入pCU202的克隆位點上，得到含螢光素酶互補基因片段lgBiT和第二檢測蛋白基因nusE的重組質粒載體pCU235；

所述第二融合蛋白中含所述第二檢測蛋白基因表達的第二檢測蛋白，以及所述螢光素酶互補基因片段表達的螢光素酶互補蛋白片段；所述螢光素酶互補蛋白片段與所述螢光素酶蛋白片段互補結合，能夠形成一個完整的且能催化螢光素酶底物發光的螢光素酶；

S03、將所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白在細胞外孵育，加入所述螢光素酶底物，檢測螢光發射情況；

當出現螢光發射現象時，指示所述第一檢測蛋白與所述第二檢測蛋白之間存在相互作用；當沒有出現螢光發射現象時，指示所述第一檢測蛋白與所述第二檢測蛋白之間不存在相互作用；

引物N?smbit_F的序列為TGGTAAAGCCCATATGGTCTTCACACTC；

引物N_lg/smbit?R的序列為AGCGGCCCCATGGGGTACCTCTAGAAG

ATCTGCTAG；

引物C_hisoligo_1的序列為TATGCCATGGGGGCCCCACCATCACCAT

CACCATTAA；

引物C_hisoligo_2的序列為CATGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGG

GCCCCCATGGCA；

引物N_lgbit?F的序列為GGTAAAGCCCATATGGTGACCGGCTACC；

引物N?lg/smbit_R的序列為AGCGGCCCCATGGGGTACCTCTAGAAG

ATCTGCTAG；

引物N_nusE_F的序列為GGCTAATCGAATTCAGTCATGGCAAAAC；

引物N_nusE_R的序列為TCCGCAGGTACCTTACAGTTTGATCTC

AAC；

引物smbit?nusB_F的序列為CGGCGAGAATTCAGTCATGAAAGAAG；

引物smbit?nusB_R的序列為GGGTTATGCTAGTTATTGCTCAG。