[發明專利]貓血清淀粉樣蛋白A及其單克隆抗體的制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811384920.2
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN109517050A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 劉清泉;胡祥葉;朱偉;項美華;武戌青;王立童;吳瓊杉;余銘恩
• 申請（專利權）人: 杭州賢至生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/70;C12N1/21;C07K16/18;C12R1/19
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 朱海江

本發明屬于生物工程技術領域，本發明涉及一種重組蛋白，該重組蛋白包含貓血清淀粉樣蛋白A的兩個優勢抗原表位，為提高該重組蛋白在原核表達系統中的產量，采用大腸桿菌偏愛密碼子將該重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列，化學合成該核苷酸序列并構建重組表達載體。本發明還涉及該重組蛋白單克隆抗體的制備，經過免疫、細胞融合及多輪篩選后得到雜交瘤細胞株，純化單克隆抗體并分別標記銪離子(Eu3+)，通過正交實驗確定最佳單抗配對組合，可用于貓感染性炎癥的早期診斷。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域。具體來說，本發明涉及一種新的重組蛋白，通過基因工程技術編碼合成該重組蛋白的核苷酸序列，構建含有上述核苷酸序列的質粒載體，轉化有上述質粒載體的大腸桿菌菌株，表達重組貓血清淀粉樣蛋白A；使用上述重組蛋白制備貓血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體，并應用于貓感染性疾病早期炎癥的診斷。

背景技術

感染性疾病由細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體引起，是常見病、多發病，嚴重威脅機體健康，因此尋找利于早期診療的感染性標志物具有重要意義。血清淀粉樣蛋白A(SAA)是存在于許多物種中的一種主要的急相蛋白，包括人、犬、貓和馬。一旦機體受到感染、創傷及外科手術等引起的炎癥刺激后，SAA濃度水平會在數小時內迅速升高。由于SAA半衰期非常短，隨著炎癥源的清除，SAA的濃度水平又會迅速下降。國內外已有研究表明，在細菌、病毒感染、急性炎癥、慢性炎癥急性發作等急性時相反應性疾病中均可檢測到血清SAA升高。與傳統感染標志物CRP和WBC 相比，其優勢在于病毒感染時也明顯升高，且改變高于傳統指標。鑒于其以上特性， SAA可作為敏感的感染性疾病標志物用于診療，成為繼WBC和CRP之后，感染性疾病早期輔助診斷的又一個新指標。因此，在貓感染性疾病炎癥診斷中，測定貓血清淀粉樣蛋白A(fSAA)可用于診斷亞臨床炎癥、監控貓炎癥和感染的治療效果。

目前，市場上關于貓感染性疾病早期炎癥的診斷主要是對貓血液細胞進行檢測分析，如測WBC(白細胞總數)、GR(中性粒細胞數)等，該方法操作繁瑣而且成本高，不適合快速診斷，易耽誤治療。

以免疫學為基礎的血清學檢測，操作簡便，結果判定簡單，是目前的主流方向。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)是目前最靈敏的微量分析技術，靈敏度可達 10-12g/mL，其利用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效排除非特異熒光干擾，極大提高了分析靈敏度。通過制備重組貓血清淀粉樣蛋白A并免疫小鼠得到相應單克隆抗體，結合時間分辨熒光免疫分析平臺篩選最佳單克隆抗體配對，從而實現對貓血清淀粉樣蛋白A的快速、高效、特異性檢測。

發明內容

設計目的：通過設計一種重組蛋白并制備其單克隆抗體，從而實現貓血清淀粉樣蛋白A(fSAA)的特異性識別檢測，既增強了檢測靈敏度，又不會導致檢測結果失真。