[發明專利]一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法

在審

• 申請號: 201811378807.3
• 申請日: 2018-11-19
• 公開（公告）號: CN109355200A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 崔大練;馬玉心
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：采集空柄小牛肝菌組織或孢子在PDA培養基上進行菌絲培養；所述PDA培養基組成包含松根粉；所述松根粉的制備方法為：取油松或落地松根系，蒸餾水洗凈，依次用25-35%酒石酸溶液、45-50%3,4-亞甲二氧基苯酚溶液和無水乙醇超聲浸泡3-5min，然后用無菌水沖洗、烘干，粉碎磨粉，備用。

2. 根據權利要求1所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述PDA培養基組成包括：以重量百分比計，馬鈴薯全粉35-40％，棉籽皮1-2％，葡萄糖5-8％，瓊脂3-5％，原產地林下浸提物15-20%，松根粉6-9%，維生素B 0.1-0.3%，蒸餾水余量，pH自然。

3.根據權利要求2所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述原產地林下浸提物制備方法為：采集野生空柄小牛肝菌產地腐殖土100-200g，于滅菌的裝有液體普通肉湯培養基的試管中進行發酵，充分振蕩混勻后置于35-38℃恒溫搖床震蕩培養36-48h，重復2-3次；將發酵好的培養液用2500-3500r/min離心3-5min，取上清液用8000-9500r/min離心5-8min，取上清液用0.1-0.5μm微孔濾膜過濾除菌，2-4℃保存備用。

4.根據權利要求1所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：包括如下步驟：

消毒與無菌檢測：對野生空柄小牛肝菌組織或孢子進行消毒并進行無菌檢測；無菌檢測方法為：將經過消毒的菌組織或孢子置于PDA培養基平板上輕輕滾動或緊貼培養基放置1-2min，接著移去菌組織或孢子，在溫度25-27℃恒溫培養，培養5-7天，無雜菌長出即說明消毒后的菌組織或孢子表面無菌；

分離培養：當菌組織或孢子在PDA培養基上長出菌絲時，無菌條件下挑取菌絲，接種于特色培養基平板上，25-27℃恒溫培養，培養1-2天，獲得優勢生長菌絲群；菌絲絨狀，中間略凸，呈同心圓生長，健壯，白色持續時間長；

菌絲純化：將分離培養所得菌絲于純化培養基上23-25℃暗培養7-10天，獲得單一的純合絲狀菌絲；菌絲純化培養基按重量百分比計由葡萄糖2-4%、瓊脂2-3%、松針汁25-35%、麥芽汁20-30%、蘆薈汁15-20%、慶大霉素0.5-1%和余量蒸餾水組成。

5.根據權利要求4所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述對野生空柄小牛肝菌組織采用35-50%酒精溶液超聲波輔助消毒，超聲波溫度為20-22℃、功率為20-35W、作用時間為5-7min；然后在無菌條件下，采用經火焰灼燒過的手術刀片從菌柄或菌蓋中部縱切、撕開，挑取菌蓋與菌柄交界處的長為0.3-0.5cm、寬為0.1-0.3cm的組織塊；對孢子進行紫外消毒：采用波長為225-300nm的紫外線，于溫度20-22℃、環境相對濕度60-65%下消毒10-15s。

6.根據權利要求4所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述對菌組織進行菌絲培養時：將分離得到的組織塊于改良的PDA培養基上21-25℃暗培養5-7天獲得菌絲；組織菌肉與改良PDA培養基的培養重量比為1:50-85；具體方法為：將組織塊直立插入培養基的中下部位中，使1/6-1/5部位露出培養基表面；插入的組織部位在培養基中得到縱向分布。

7.根據權利要求4所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述對菌孢子進行菌絲培養時：將孢子囊小塊，先采用波長為250-290nm的紫外線照射5-8min，然后接種于改良的PDA培養基上21-25℃暗培養5-7天獲得菌絲；野生空柄小牛肝菌的孢子無菌水的接種量為0.01-0.03%。

8.根據權利要求4所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述特色培養基配方組成為：培養基基質為蛭石:麥粒:谷糠=1:1-2:1，液體為稀釋3-4倍的MRD；pH值為5-6。

9.根據權利要求4所述的一種空柄小牛肝菌菌絲的分離純化方法，其特征在于：將純化得到的絲狀菌絲進行特色培養基擴大培養，26-28℃培養7-10天，得空柄小牛肝菌菌落：菌落直徑達80-85mm，菌落表面絨狀，中央略凸為棕灰色，四周為白色，呈同心圓生長，濃密粗壯，無色素分泌。