[發明專利]檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811375417.0
• 申請日: 2018-11-19
• 公開（公告）號: CN109283348A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 劉晶;李祎;劉群
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/96
• 分類號: G01N33/96;G01N33/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 王芊雨;周際

1.一種檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于，所述雙抗體夾心ELISA試劑盒包括：

捕獲抗體，所述捕獲抗體為弓形蟲GRA1單克隆抗體，該捕獲抗體的效價為5×10⁶，抗體亞型為IgG1；以及

HRP標記的檢測抗體，所述檢測抗體為鼠源弓形蟲GRA1多克隆抗體，該檢測抗體的效價為1.28×10⁵。

2.如權利要求1所述的檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于，所述雙抗體夾心ELISA試劑盒還包括：

96孔酶標反應板；

包被液，所述包被液是pH值為9.6的50mM碳酸鹽緩沖液；

封閉液及樣品稀釋液，所述封閉液及樣品稀釋液是5％的脫脂奶；

洗滌液，所述洗滌液是含有0.5％Tween-20的磷酸鹽緩沖液；

TMB底物顯色液；

終止液，所述終止液是2mol/L的H₂SO₄溶液；

標準陽性血清；以及

標準陰性血清。

3.如權利要求1或2所述的檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于，包括：

(1)所述捕獲抗體的制備方法為：使用弓形蟲GRA1-His重組蛋白免疫小鼠，篩選出陽性雜交瘤細胞，將該陽性雜交瘤細胞給小鼠腹腔注射，連續收集腹水，純化腹水中的弓形蟲GRA1單克隆抗體，即得；

(2)所述HRP標記的檢測抗體的制備方法為：將弓形蟲GRA1-His重組蛋白加弗氏佐劑乳化后，免疫小鼠，采集血液、分離血清，純化血清中的弓形蟲GRA1多克隆抗體，將純化之后的弓形蟲GRA1多克隆抗體使用HRP標記，即得；

(3)所述包被液的制備方法為：稱取Na₂CO₃ 1.43g和NaHCO₃ 3.066g，溶于1000mL蒸餾水中，4℃保存備用；

(4)所述封閉液及樣品稀釋液的制備方法為：稱取5g脫脂奶粉溶于100mLPBS中，現配現用；

(5)所述洗滌液的制備方法為：在1LPBS中加入0.5mL Tween-20；

(6)所述TMB底物顯色液的制備方法為：稱取TMB 200mg，加入無水乙醇100mL，調pH值5.0，加雙蒸水定容至1000mL，制成底物A液；另外稱取檸檬酸9.33g，Na₂HPO₄ 14.60g，加入6.4mL H₂O₂，調pH值5.0，加雙蒸水定容至1000mL，制成底物B液，將所述底物A液與底物B液以1:1的體積比加入顯色；

(7)所述終止液的制備方法為：將濃硫酸22.2mL倒入蒸餾水178.8mL制得；

(8)所述標準陽性血清是加入了100ng/mL弓形蟲GRA1-His重組蛋白的FBS；以及

(9)所述標準陰性血清為未加弓形蟲GRA1-His重組蛋白的FBS。

4.如權利要求3所述的檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于，所述捕獲抗體的制備方法如下：

用弓形蟲GRA1-His重組蛋白免疫小鼠，三免后取小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合，用弓形蟲GRA1-GST重組蛋白為包被物建立間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，將該陽性雜交瘤細胞給小鼠腹腔注射，連續收集腹水，進而純化腹水中的單克隆抗體，經過SDS-PAGE鑒定純化效果，得到所述捕獲抗體。