[發明專利]檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811375417.0
• 申請日: 2018-11-19
• 公開（公告）號: CN109283348A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 劉晶;李祎;劉群
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/96
• 分類號: G01N33/96;G01N33/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 王芊雨;周際

本發明公開了一種檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒及制備方法和應用，所述雙抗體夾心ELISA試劑盒包括：捕獲抗體，所述捕獲抗體為弓形蟲GRA1單克隆抗體，該捕獲抗體的效價為5×10⁶，抗體亞型為IgG1；以及HRP標記的檢測抗體，所述檢測抗體為鼠源弓形蟲GRA1多克隆抗體，該檢測抗體的效價為1.28×10⁵；該雙抗體夾心ELISA試劑盒操作簡便、受環境因素影響小，無種屬特異性，相比多克隆抗體建立的診斷方法具有更高的敏感性和特異性。

技術領域

本發明是關于血清學檢測領域，特別是關于一種檢測多種動物血清中弓形蟲循環抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒及制備方法和應用。

背景技術

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生原蟲，在全球范圍內廣泛傳播，據估計全球約有三分之一的人群表現弓形蟲血清抗體陽性。在家畜中同樣流行廣泛，其中以豬的感染率較高。弓形蟲感染可依據宿主發病的輕重緩急分為急性弓形蟲病和慢性弓形蟲病，急性弓形蟲病相對而言對家畜的危害更大。豬急性弓形蟲病常引起母豬流產、死胎等繁殖障礙，仔豬發熱、呼吸困難甚至死亡等，給養殖業造成巨大的經濟損失；而且豬作為人類重要的肉制品來源，在人弓形蟲病的傳播上發揮了重要作用。因此，研發一種高效、便捷的急性弓形蟲病診斷方法非常必要。

急性弓形蟲病常見的診斷方法包括病原學、血清學、分子生物學和免疫病理學等。病原學和分子生物學診斷方法(如PCR)結果雖然直觀可靠，但病原學診斷操作復雜、檢出率低、周期長，易出現假陰性，分子生物學診斷方法需要使用專用設備，檢測時間和費用較高。血清學診斷常用的方法有抗體親和力試驗、間接免疫熒光試驗(IFA)以及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，但是也都有不同程度的缺陷。抗體親和力的變化與弓形蟲感染進程并不是完全相符，例如妊娠期間IgG親和力可能在蟲體感染后很長時間內不會上升，有可能造成假陽性檢測結果。IFA檢測弓形蟲早期感染是通過體內IgM水平來診斷，但其檢測的敏感性遠不如ELISA方法，而且實驗需要特殊的儀器設備，對結果的判斷具有主觀性，假陽性率高，目前主要用于實驗室檢測。ELISA方法具有敏感特異、操作方便快捷、重復性好等優勢，并且可以用于基層大批量臨床樣品的檢測。

弓形蟲病的診斷常以檢測血清中IgG抗體為目標，但是高親和力IgG抗體的存在僅能表示弓形蟲感染至少發生在檢測前3-4個月。目前在臨床上常用的指示急性弓形蟲病的是IgM抗體，但僅是IgM抗體陽性不能確定是否有近期弓形蟲感染，因為IgM可在機體內存在數月甚至幾年，造成假陽性診斷結果。而弓形蟲循環抗原(CAg)是指弓形蟲在宿主體內入侵、運動和增殖過程中產生的代謝和裂解產物，通常在弓形蟲感染早期或活動期的血清中出現，而且出現時間一般早于IgM，可以說是確診急性弓形蟲病的直接證據，相比抗體檢測，CAg能更準確的診斷急性弓形蟲病。

弓形蟲致密顆粒蛋白1(GRA1)是CAg的重要組成部分，具有良好的免疫原性，是一種良好的疫苗候選分子，也是弓形蟲病診斷常見的候選抗原。弓形蟲在入侵宿主細胞時及入侵后均能分泌GRA1到納蟲空泡(PV)內，調節PV內鈣離子濃度，起到調節、修飾納蟲空泡膜(Parasitophorous vacuole membrane，PVM)的作用，抵抗宿主溶酶體的攻擊，是弓形蟲生長發育必不可少的重要功能蛋白；而且不同發育時期和不同基因型的弓形蟲均能穩定分泌，表達量較高，這十分利于弓形蟲的檢測。

目前，國內外學者已建立了多種關于血清CAg檢測方法，例如基于SAG3單抗的雙抗體夾心ELISA(寇金華)，但檢測下線為稀釋640倍的標準陽性樣品，并未對陽性樣品中的循環抗原進行定量檢測；Rui Chen等建立了一步法夾心ELISA方法，檢測下線為血清中31.2ng/mL循環抗原，但該方法使用的是檢測抗體和捕獲抗體均為弓形蟲全蟲多抗。

綜上所述，發明一種特異性強、敏感性高，操作簡便的夾心ELISA方法對多種動物急性弓形蟲病的診斷具有重要的意義。