[發(fā)明專利]一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811367703.2
• 申請日: 2018-11-16
• 公開（公告）號: CN109517776A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳同壘;史秋梅;張志強;于秀劍;杜萬年;柳翠翠;高桂生
• 申請（專利權(quán)）人: 河北科技師范學(xué)院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株在降低腸炎沙門菌毒力中的應(yīng)用。

2.一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株在開發(fā)腸炎沙門菌疫苗中的應(yīng)用。

3.一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)一次重組菌株腸炎沙門菌c50336::cat的構(gòu)建

以質(zhì)粒pKD3為模板制備氯霉素目的基因片段，以攜帶質(zhì)粒pKD46的腸炎沙門菌c50336制備感受態(tài)細胞，將所述氯霉素目的基因片段和所述感受態(tài)細胞混合電擊轉(zhuǎn)化，復(fù)壯后涂布氯霉素平板，培養(yǎng)24-48h，挑取陽性菌，去除質(zhì)粒pKD46，獲得腸炎沙門菌c50336::cat；

(2)二次重組菌株腸炎沙門菌c50336ΔicdA的構(gòu)建

將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入所述腸炎沙門菌c50336::cat，篩選丟失氯霉素片段的腸炎沙門菌c50336ΔicdA，并利用PCR進行鑒定。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中制備氯霉素目的基因片段的具體方法為：以質(zhì)粒pKD3為模板，使用引物P1、P2克隆氯霉素目的基因片段，回收目的基因片段，并溶解在去離子水中；其中所述引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-TCCCGCTGAAACCCTTGATTTAATTCGTGACTACCGCGTAGCGATTAAAGGTCCATTGATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；SEQ ID NO.1；

P2：5’-GCATCATCTCCGCAGACAGAATAATGGAGCCTGGGTTGACTTTATCCTGGCCCGCATATCATATGAATATCCTCCTTAG-3’；SEQ ID NO.2。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述感受態(tài)細胞的制備方法為：向培養(yǎng)至對數(shù)期的攜帶質(zhì)粒pKD46的腸炎沙門菌c50336的菌液中加入阿拉伯糖誘導(dǎo)2-3h，冰浴10-15min后洗滌，最后利用去離子水重懸得到所述感受態(tài)細胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述阿拉伯糖的終濃度為30mmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，冰浴后所述洗滌方法為用預(yù)冷的0℃的去離子水洗滌3-4次。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述陽性菌去除質(zhì)粒pKD46的方法為：將陽性單菌落接種于1.5mL液體氯霉素LB培養(yǎng)基中，42℃熱激培養(yǎng)4h，去除質(zhì)粒pKD46，并經(jīng)抗生素篩選Amp敏感、氯霉素耐受菌株為陽性菌株，最后進行PCR鑒定。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種腸炎沙門菌icdA基因缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述利用PCR進行鑒定腸炎沙門菌c50336ΔicdA的引物如下：

P5：5’-ACAGACGAGCAAACCAGAAGC-3’；SEQ ID NO.5；

P6：5’-CCATCAGGCGTTCAAAGTCAT-3’；SEQ ID NO.6。