[發明專利]一種檢測人運動神經元存活基因拷貝數的相對定量試劑盒

在審

• 申請號: 201811365890.0
• 申請日: 2018-11-16
• 公開（公告）號: CN109554459A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 許舒婷;鄭毓仁;葉曜榮
• 申請（專利權）人: 德必碁生物科技(廈門)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;饒文君

本發明涉及基因檢測領域，具體涉及一種用于檢測人運動神經元存活基因拷貝數的試劑盒。本發明提供種多重熒光PCR法檢測人運動神經元存活基因的拷貝數，分別設計SMN1基因第7及第8外顯子、SMN2基因第7及第8外顯子、SMN基因第6外顯子和內參基因CFTR的特異性引物和探針。本發明的設計巧妙，可通過3個獨立PCR反應分別對SMN1基因第7及第8外顯子、SMN2基因第7及第8外顯子、SMN基因第6外顯子進行拷貝數的相對定量。本發明操作簡便、特異性強、靈敏度佳，SMN基因第6外顯子拷貝數結果，可提升結果的準確性，更適合用于臨床脊髓性肌萎縮癥患者的分型及攜帶者的篩查。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，具體涉及一種用于檢測人運動神經元存活基因拷貝數的試劑盒。

背景技術

脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy, SMA），為一種常見的常染色體隱性遺傳疾病，因位于第五號染色體（5q13）的人運動神經元存活基因1（Survival of MotorNeuron 1, SMN1）產生大片段缺失、轉換或點突變等，其中95%以上為第7號外顯子和/或第8號外顯子大片段缺失；導致漸進性退化、對稱性肌肉無力、萎縮等病征。新生兒發病率為1/6,000~1/10,000，在正常人群中攜帶率為1/40~1/60。根據臨床癥狀與發病年齡可將SMA分為四型，其中I~III型稱為兒童型SMA：SMA I型為最嚴重的亞型，患者在出生后6個月內發病，一般生存期在2歲以內；SMA II型為中度型，患者通常在6~18個月內發病，其生存期仰賴于外來健康支援照護，可存活至成年；SMA III型為輕度型，患者由出生后18個月至成年都有可能發病，其病情進展較為緩慢，最終仍死于呼吸肌麻痹，SMA IV型為成人型，30歲后發病，癥狀輕微，生存期正常。該病居致死性常染色體隱性遺傳病的第二名，目前尚無治療手段。

目前的研究已確立SMA的致病決定基因為SMN1基因缺陷，其中SMN2基因拷貝數與SMA表型的輕重直接相關。透過SMN基因拷貝數的相對定量檢測，應用于產前篩查可有效預防出生缺陷，降低社會照護成本；抑或是對患者分型診斷皆具有臨床評價意義。

現有的SMA致病基因診斷技術包含：聚合酶鏈反應─單鏈構象多態性(PCR-SSCP)、聚合酶鏈反應─限制酶片段長度多態性(PCR-RFLP)、變性高效液相分析(DHPLC)、高分辨熔解曲線(HRM)、多重連接探針擴增(MLPA)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-Time PCR)等技術。然而，PCR-RFLP僅適用于檢測SMN1基因的純合缺失，無法辨識出SMN1基因雜合缺失的SMA致病基因攜帶者的正常人；無論是DHPLC與MLPA均需在PCR反應結束后，開管對PCR產物進行后續處理分析，在操作過程中容易造成環境污染。

目前臨床上SMA的常規檢測多使用荷蘭MRC公司生產的多重連接探針擴增(Multiple Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)檢測試劑盒，該試劑盒使用多組參考探針對SMN基因拷貝數進行半定量檢測，然而MLPA所需的設備門檻與試劑成本高。因此本發明于多重熒光PCR的技術上，除了檢測SMN1基因、SMN2基因第7及第8外顯子的拷貝數外，增加SMN基因第6外顯子拷貝數的相對定量以復核SMN1基因與SMN2基因的拷貝數結果，在提高操作便利性的同時也增加整體檢測結果的準確度。

隨著我國出生缺陷防控政策的相繼執行，SMA致病機制與分子機制也已明朗，因此開發準確可靠、便利經濟，同時能實現標準化、規模化的檢測試劑盒，進行SMN1基因、SMN2基因狀態的識別，對SMA的防治與篩查及患者的分型診斷為首當之務。

發明內容

本發明的目的針對現有技術的不便與不足，提供一種多重實時熒光PCR法檢測人運動神經元存活基因拷貝數的相對定量試劑盒及其應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：