[發明專利]一種混合菌發酵生產L-哌啶甲酸的方法

有效

• 申請號: 201811365167.2
• 申請日: 2018-11-16
• 公開（公告）號: CN109337942B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 陳可泉;劉易辰;應晗笑;王昕;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12N15/70;C12N15/60
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種混合發酵生產L?哌啶甲酸的方法，以產賴氨酸的菌株和過表達賴氨酸環化脫氨酶的菌株作為發酵菌株生產L?哌啶甲酸，其中，所述的賴氨酸環化脫氨酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明以葡萄糖為底物，通過兩個菌株共同發酵生產L?哌啶甲酸。

技術領域

本發明涉及一種混合菌發酵生產L-哌啶甲酸的方法，屬于發酵技術領域。

背景技術

哌啶甲酸是一種手性分子，是多種雜環聚酮類手性藥物生產合成的重要前體。如雷帕霉素，FK506及FK520等。它們有潛在的免疫抑制劑活性，神經營養活性和抗真菌活性。當前雷帕霉素及其類似物在臨床上可用于預防器官移植后的免疫排斥、治療晚期腎癌、作為皮膚病學及心臟病學領域的藥物。哌啶甲酸衍生物則負責構成這類化合物的共同核心結構特征：FKBP12結合基序，這個結構基序可參與它們與FKBP12的結合。哌啶甲酸對于這類化合物的生物合成是必不可少的，哌啶甲酸的供給是影響其產量的重要因素。1997年，LeeM.S.等人的報道認為增量供給L-賴氨酸時，L-哌啶甲酸的水平得到了提高，從而使雷帕霉素產量也得到了提高。在2013年，Xia等人的報道中，提高FK506生產菌株中的哌啶甲酸合成基因的表達水平后，FK506的產量也增加了。另外，哌啶甲酸還參與合成抗腫瘤藥物VX710、苦馬豆堿等，抗生素山卓霉素、萬可霉素等，在醫學及生理學等領域具有非常高的應用價值。哌啶甲酸可以作為這些重要藥物的前體之外，也有很多關于L-哌啶甲酸自身的生物活性及臨床應用的報道。

在2001年以前，L-哌啶甲酸主要通過化學合成來生產。然而，對于手性化合物來說使用化學合成相對較為困難，往往步驟繁雜，并且會污染環境。隨著最近二三十年中對人們生產哌啶甲酸的酶的認識的進步，生物合成法也逐漸發展起來。2002年，Fuji及其同事偶然發現了一個來自大腸桿菌中的由proC編碼的P5C還原酶可還原哌啶-6-羧酸，而P5C還原酶與L-賴氨酸ε-轉氨酶共同作用可將L-賴氨酸轉化為L-哌啶甲酸。他們構建了過表達這兩種酶的工程菌株，經159h的培養發酵，成功生產了3.9g/L的L-哌啶甲酸；2015年，YasushiTani及其同事，在大腸桿菌中構建了來自日本鯖魚(Scomber japonicus)的L-賴氨酸α-氧化酶，以及來自惡臭假單胞菌的P2C還原酶，發酵45h生產了45.1g/L高光學純的L-哌啶甲酸。2016年，Fernando Pérez-García等人在一株賴氨酸高產的谷氨酸棒狀桿菌構建了來自Silicibacter pomeroyi的L-賴氨酸6-脫氫酶基因LysDH及proC，首次完成了以葡萄糖為起點的L-哌啶甲酸轉化，其總產率約為0.09g/g。

盡管有多篇關于生物法合成L-哌啶甲酸的報道，但其中大多都是構建兩種及以上的酶才能實現L-哌啶甲酸的轉化。而使用賴氨酸環化脫氨酶(Lysine cyclodeaminase,LCD)生產L-哌啶甲酸僅需一種酶即可完成賴氨酸的脫氨、環化和還原的過程，生產哌啶甲酸。無論從初始構建成本、后續轉化效率還是菌株穩定性等方面考慮都具有很大的優勢。然而，天然LCD常溫下轉化速率相對較小，在高溫(60°以上)有較高的反應速率但酶在此溫度下酶活卻迅速降低。2017年，Ying等人將來自S.pristinaespiralis的LCD進行了定向突變改造，獲得了pipA-V61-V94，將酶活提高了約1.8倍。同年他們將帶有包含pipA-V61-V94在內的五種基因、共三種重組質粒導入同一株菌中，用于從葡萄糖生產L-哌啶甲酸，其產率達到了0.13g/g。但是這種轉化方法需共同表達多種蛋白，存在構建難度高、穩定性差等不利特性。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種L-哌啶甲酸的新型發酵生產方法，解決目前存在的困難，可以經濟地、簡便地、穩定地、大規模地生產L-哌啶甲酸。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：