[發明專利]不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法

在審

• 申請號: 201811364997.3
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109402230A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 李振;郝慧琴;高玉亭;王澤
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及醫療技術領域，公開了不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法，包括如下步驟：試驗動物及其組織的處理；總RNA提取及cDNA合成；引物設計、合成和PCR檢測；序列測定；相對定量標準曲線的建立；Tp53 mRNA水平檢測；數據處理以及結果分析。本發明的不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法，建立CIA大鼠模型，通過PCR檢測引物特異性，建立標準曲線，qRT?PCR檢測不同濃度二妙散灌胃大鼠后Tp53 mRNA的表達水平，相比現有技術，本發明可以為研究CIA大鼠Tp53的作用機制提供試驗基礎，同時也為研究二妙散治療類風濕關節炎的藥理機制提供理論依據。

技術領域

本發明涉及醫療技術領域，特別涉及不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法。

背景技術

類風濕關節炎(RA)是以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、系統性自身免疫性疾病。基本病理改變為滑膜炎、血管翳形成，并逐漸出現關節軟骨和骨破壞，最終導致關節畸形和功能喪失。我國RA患病率為0.32％-0.36％，其中女性發病率是男性的1-3倍，是威脅人類健康的重大疾病之一，屬WHO規定的現代難治病范疇。膠原誘導關節炎模型(collagen induced arthritis CIA)是一種經典的類風濕關節炎動物模型，被廣泛應用于評估可能的病因病理，也被用于評估新的治療方法。目前對動物模型的研究以對關節滑膜炎癥、骨及軟骨破壞為主，對其他臟器的研究較少。

二妙散作為中醫治療類風濕關節炎的經典方劑，出自《丹溪心法》由蒼術和黃柏等比配伍而成，黃柏苦寒清熱，蒼術苦溫燥濕，為祛濕劑，具有清熱燥濕之功效，為治陰分之濕熱痿證的妙藥。Tp53腫瘤抑制基因調節機體生物過程的發生，如應激反應、細胞周期、增殖、侵襲、衰老、細胞凋亡和自噬，其編碼蛋白(p53)主要通過誘導生長停滯、細胞凋亡、衰老和抑制血管生成，從而引起關節滑膜纖維化，導致炎癥的發生。目前，二妙散治療類風濕關節炎的藥理機制還缺乏理論依據。

發明內容

發明的目的在于提供不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法，本發明建立CIA大鼠模型，通過PCR檢測引物特異性，建立標準曲線，qRT-PCR檢測不同濃度二妙散灌胃大鼠后Tp53 mRNA的表達水平，相比現有技術，本發明可以為研究CIA大鼠Tp53的作用機制提供試驗基礎，同時也為研究二妙散治療類風濕關節炎的藥理機制提供理論依據，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法，包括如下材料：Wistar雌性大鼠、飼喂基礎日糧+水、牛II型膠原、甲氨蝶呤、二妙散用藥組，試驗步驟如下：

步驟一：試驗動物及其組織的處理

選取72只42±2日齡健康狀況良好、體重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為6個試驗組：I組，空白對照組(n＝12)：飼喂基礎日糧+水；II組，模型CIA組(n＝12)：多點皮下注射牛II型膠原；III組，陽性對照組(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤(MTX)按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；IV組，高濃度二妙散用藥組(n＝12)：每天早上9：00，按4.5g/kg灌胃，持續3周；V組，中濃度二妙散用藥組(n＝12)：每天早上9：00，按3.0g/kg灌胃，持續3周；VI組，低濃度二妙散用藥組(n＝12)：每天早上9：00，按1.5g/kg灌胃，持續3周；

步驟二：總RNA提取及cDNA合成