[發明專利]不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法

在審

• 申請號: 201811364997.3
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109402230A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 李振;郝慧琴;高玉亭;王澤
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法，其特征在于，包括如下材料：Wistar雌性大鼠、飼喂基礎日糧+水、牛II型膠原、甲氨蝶呤、二妙散用藥組，試驗步驟如下：

步驟一：試驗動物及其組織的處理

選取72只42±2日齡健康狀況良好、體重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為6個試驗組：I組，空白對照組(n＝12)：飼喂基礎日糧+水；II組，模型CIA組(n＝12)：多點皮下注射牛II型膠原；III組，陽性對照組(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤(MTX)按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；IV組，高濃度二妙散用藥組(n＝12)：每天早上9：00，按4.5g/kg灌胃，持續3周；V組，中濃度二妙散用藥組(n＝12)：每天早上9：00，按3.0g/kg灌胃，持續3周；VI組，低濃度二妙散用藥組(n＝12)：每天早上9：00，按1.5g/kg灌胃，持續3周；

步驟二：總RNA提取及cDNA合成

取出-80℃保存的CIA大鼠關節組織，按照RNAiso Plus操作說明提取總RNA，核酸蛋白測定儀ND-2000測定總RNA濃度和純度，RNA濃度調至1.0μg·L^-1，-80℃保存，根據PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作說明，反轉錄；

步驟三：引物設計、合成和PCR檢測

根據NCBI GenBank公布的大鼠Tp53 cDNA參考序列，使用Primer 5.0設計1對Tp53特異性引物，送公司合成，使用前用滅菌超純水溶解稀釋至100pmol/μL，-20℃保存備用，使用15μL PCR反應體系：正反向引物(10μmol·L^-1)各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH₂O 5.5μL，2×M5HiPerTaq PCR mix(with Green Dye)7.5μL；

步驟四：序列測定

按照pEASY-T3 cloning Kit說明，將回收的Tp53 cDNA片段連接至T3 Cloing Vector，PCR儀中25℃恒溫10min，使回收產物與T3 Cloing Vector充分連接，連接產物導入感受態細胞，涂布到LB固體培養基，37℃過夜培養，藍白斑篩選，挑取白色單菌落，LB液體培養基培養12-16h，菌液交由公司測序；

步驟五：相對定量標準曲線的建立

將含Tp53 cDNA模板按照2×稀釋8個梯度，制備標準品，分別為：1.0×2⁰，1.0×2^-1，1.0×2^-2，1.0×2^-3，1.0×2^-4，1.0×2^-5，1.0×2^-6，1.0×2^-7，使用CFX96^TM實時PCR檢測系統檢測，ddH₂O代替模板作為陰性對照，qRT-PCR反應體系為：TB Green Advantage qPCR Premix 10μL，正反向引物各0.5μL，cDNA模板2.0μL，ddH₂O 7.0μL，總體積20μL，反應程序：95℃變性10sec，95℃ 5sec，60℃ 25sec，共45個循環；

步驟六：Tp53 mRNA水平檢測

qRT-PCR檢測試驗大鼠關節中Tp53 mRNA相對表達量，根據TB Green qPCR MasterMix-TB Green Advantage試劑盒建議的反應條件，構建反應體系同步驟五，每個樣本重復3次，根據Ct值，利用2^-ΔΔCt法計算試驗大鼠關節中Tp53 mRNA相對表達量；

步驟七：數據處理

使用SPSS 24.0軟件分析所有數據，統計分析基于ANOVA，Duncan法進行多重比較，圖使用Origin 2017生成。

2.根據權利要求1所述的不同濃度二妙散對CIA大鼠關節中Tp53 mRNA水平表達的試驗方法，其特征在于，步驟1的二妙散藥物制備步驟包括：將蒼術和黃柏按1∶1煎煮，生藥量不低于0.5g/mL；并依據標準品蒼術素，測定二妙散水煎劑的成分含量，穩定質控。