[發(fā)明專利]一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811359982.8
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109141959A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程李香;張峰;王玉萍
• 申請（專利權(quán)）人: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N1/06
• 分類號: G01N1/06;G01N1/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，采用延長鋨酸固定時間和梯度滲透法達(dá)到切片完整，沒有碎裂，透射電鏡下觀察結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，用于馬鈴薯塊莖超微結(jié)構(gòu)的研究。其步驟包括：（1）樣品采集與固定；（2）漂洗；（3）后固定；（4）漂洗；（5）脫水；（6）浸透；（7）包埋；（8）聚合；（9）超薄切片；（10）雙重染色。本發(fā)明提高了馬鈴薯塊莖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的保存效果；提高了塊莖樣品的滲透效果；本發(fā)明中塊莖樣品的純包埋劑浸透過程是放置在干燥器中進(jìn)行的，可以使丙酮被徹底揮發(fā)掉，增加了樹脂的切割性能，避免了由于樹脂受潮發(fā)軟而導(dǎo)致切片上出現(xiàn)波浪型條紋。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及超薄切片制作技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法。

背景技術(shù)

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）塊莖既是無性繁殖器官，又是營養(yǎng)儲藏器官。馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不僅是其生物學(xué)特性的重要內(nèi)容，也對塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的形成具有重要影響。目前，運(yùn)用透射電鏡是觀察生物超微結(jié)構(gòu)最常用的方法，其中透射電鏡超薄切片樣品的制備是生物超微結(jié)構(gòu)研究的關(guān)鍵，但是從取材到染色涉及多個步驟，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響到樣品制備質(zhì)量甚至導(dǎo)致樣品制備失敗。擁有一套最佳的關(guān)于馬鈴薯塊莖的透射電鏡樣品制備方法，可以為塊莖形成和發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)，對馬鈴薯生產(chǎn)中產(chǎn)量和品質(zhì)形成管理和控制具有重要意義。

現(xiàn)有技術(shù)存在的問題：有關(guān)馬鈴薯塊莖形態(tài)學(xué)方面的研究，前人所用方法基本停留在光鏡水平，偶有涉及透射電鏡，也只是對所用方法大概的描述，步驟較為繁瑣且效果不理想。作為植物材料，馬鈴薯塊莖細(xì)胞含有細(xì)胞壁，富含淀粉，組織堅(jiān)硬，包埋劑不易滲透，很難制備出高分辨的透射電鏡樣品，往往導(dǎo)致切片易破碎、細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊或細(xì)胞器丟失等現(xiàn)象，從而限制了透射電鏡在馬鈴薯研究中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，采用延長鋨酸固定時間和梯度滲透法達(dá)到切片完整，沒有碎裂，透射電鏡下觀察結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，用于馬鈴薯塊莖超微結(jié)構(gòu)的研究。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片的制作方法。以解決切片完整，沒有碎裂，透射電鏡下觀察結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，用于馬鈴薯塊莖超微結(jié)構(gòu)的研究。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片的制作方法，其主要特點(diǎn)在于包括以下步驟：

（1）樣品采集與固定：用雙面刀片切取馬鈴薯塊莖上待研究部位處1 mm³大小的電鏡樣品，將其迅速放入2.5%戊二醛固定液中，置于4℃，固定24-48 h。

（2）漂洗：將步驟（1）固定好的塊莖樣品用0.2 M磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min。

（3）后固定：將步驟（2）漂洗好的塊莖樣品放入1%鋨酸中進(jìn)行后固定，置于4℃，固定5 h。

（4）漂洗：將步驟（3）1%鋨酸固定后的樣品，用0.2 M磷酸緩沖液漂洗3次，每次15min。

（5）脫水：先用50%、70%、80%、90%和100%乙醇進(jìn)行逐級脫水，每次15 min；再用純丙酮脫水2次，每次15 min。

（6）浸透：用包埋劑和純丙酮混合液（1:3）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（2:3）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（1:1）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（3:2）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（3:1）室溫浸透1 h，然后用純包埋劑室溫浸透過夜，純包埋劑的浸透放置在干燥器中進(jìn)行。