[發明專利]一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法

在審

• 申請號: 201811359982.8
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109141959A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 程李香;張峰;王玉萍
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: G01N1/06
• 分類號: G01N1/06;G01N1/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）樣品采集與固定；（2）漂洗；（3）后固定；（4）漂洗；（5）脫水；（6）浸透；（7）包埋；（8）聚合；（9）超薄切片；（10）雙重染色。

2.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（1）樣品采集與固定：用雙面刀片切取馬鈴薯塊莖上待研究部位處1 mm³大小的電鏡樣品，將其迅速放入2.5%戊二醛固定液中，置于4℃，固定24-48 h。

3.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（2）漂洗：將步驟（1）固定好的塊莖樣品用0.2 M磷酸緩沖液漂洗3次，每次15min。

4.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（3）后固定：將步驟（2）漂洗好的塊莖樣品放入1%鋨酸中進行后固定，置于4℃，固定5 h。

5.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（4）漂洗：將步驟（3）1%鋨酸固定后的樣品，用0.2 M磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min。

6.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（5）脫水：先用50%、70%、80%、90%和100%乙醇進行逐級脫水，每次15 min；再用純丙酮脫水2次，每次15 min。

7.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（6）浸透：用包埋劑和純丙酮混合液（1:3）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（2:3）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（1:1）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（3:2）室溫浸透1 h，包埋劑和純丙酮混合液（3:1）室溫浸透1 h，然后用純包埋劑室溫浸透過夜，純包埋劑的浸透放置在干燥器中進行；所使用包埋劑的配方：包埋劑總體積為30mL，其中NMA（甲基內次甲基四氫鄰苯二甲酸酐）7.05 mL，SPI-PON 812（環氧樹脂812）13.68mL， DDSA（十二烷基琥珀酸酐）9.22 mL，DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）0.45 mL。

8.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（7）包埋：用牙簽將步驟（6）浸透好的塊莖樣品根據切向挑入包埋板樣品槽中的合適位置，然后用裝有純包埋劑且去除針頭的注射器向樣品槽中加滿純包埋劑。

9.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（9）超薄切片：用LEICA EM UC6超薄切片機進行切片，切片厚度為50-70 nm。

10.根據權利要求1所述的一種用于透射電鏡觀察的馬鈴薯塊莖超薄切片制作方法，其特征在于，所述（10）雙重染色：先用5%醋酸鈾-乙醇溶液染色30 min，再用鉛液染色8 min；所使用5%醋酸鈾-乙醇溶液的配方：將5 g醋酸鈾溶解于100 mL70%乙醇溶液中；所使用鉛液的配方：硝酸鉛1 g；醋酸鉛 0.5 g；枸櫞酸鈉 1.75 g；1 M NaOH溶液9 mL；雙蒸水定容至20mL。