[發明專利]一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法

有效

• 申請號: 201811359052.2
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109811037B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 張立;俞英
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/48;C12Q1/34
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜;裘暉

1.一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將熒光標記的羥甲基化DNA雜交鏈和過飽和的DNA去甲基化酶加入到溶劑中，混合均勻，得到混合溶液I，然后檢測混合溶液I的熒光信號，記錄信號值F₀；再將混合溶液I置于恒溫環境中溫浴，并檢測溫浴后的混合溶液I的熒光信號，記錄信號值F₁；

(2)將目標DNA雜交鏈、甲基轉移酶底物和甲基轉移酶加入至溫浴后的混合溶液I中，得到混合溶液II；然后將混合溶液II置于恒溫環境中進行甲基化反應，再按相同時間間隔，抽取混合溶液II進行熒光信號檢測，直至信號強度進入平臺期，記錄不同時間的信號值F₂；

(3)①分別計算不同時間的信號值F₂與信號值F₀的差值或比率，進行DNA甲基化動態過程分析；

或者是：

②分別計算不同時間的信號值F₂與信號值F₁的差值或比率，進行DNA甲基化動態過程分析；

步驟(1)中所述的溶劑為NE Buffer 2溶液；

步驟(1)中所述的溫浴的條件為：35～40℃溫浴45～60分鐘；

步驟(2)中所述的恒溫環境的溫度為35～40℃；

步驟(2)中所述的時間間隔為7～15分鐘；

步驟(3)①中所述的計算不同時間的信號值F₂與信號值F₀的差值或比率的適用條件為：當信號值F₂比信號值F₀的信號低20％時，計算信號值F₂與信號值F₀的差值；反之，計算信號值F₂與信號值F₀的比率。

2.根據權利要求1所述的DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的混合溶液I中熒光標記的羥甲基化DNA雜交鏈的濃度為1μM，DNA去甲基化酶的濃度為100～400nM；

步驟(2)中所述的混合溶液II中DNA去甲基化酶的濃度為50～200nM；

步驟(2)中所述的混合溶液II中甲基轉移酶的濃度為50～175μM；

步驟(2)中所述的混合溶液II中熒光標記的羥甲基化DNA雜交鏈的濃度為500nM，目標DNA雜交鏈的濃度為500nM，甲基轉移酶底物的濃度為1μM。

3.根據權利要求2所述的DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的混合溶液II中DNA去甲基化酶的濃度為100～200nM；

步驟(2)中所述的混合溶液II中甲基轉移酶的濃度為125nM。

4.根據權利要求1所述的DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的DNA去甲基化酶為TET酶；

步驟(2)中所述的甲基轉移酶為Dnmt3a，MspI，Dnmt1，Dnmt2，Dnmt3b，Dnmt3L或MspII。

5.根據權利要求4所述的DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的DNA去甲基化酶為TET2；

步驟(2)中所述的甲基轉移酶為Dnmt3a。

6.根據權利要求1所述的DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的熒光標記為采用6-FAM進行標記；

步驟(2)中所述的甲基轉移酶底物為S-腺苷甲硫氨酸。