[發明專利]一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法

有效

• 申請號: 201811359052.2
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109811037B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 張立;俞英
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/48;C12Q1/34
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜;裘暉

本發明公開了一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法。該方法包括如下步驟：(1)將熒光標記的羥甲基化DNA雜交鏈和過飽和的DNA去甲基化酶加入到溶劑中，并進行熒光信號檢測，記錄初始信號值F₀；再將獲得的混合溶液進行溫浴，并檢測溫浴后的混合溶液的熒光信號，記錄信號值F₁；(2)將目標DNA雜交鏈、甲基轉移酶底物和甲基轉移酶加入至溫浴后的混合溶液中進行甲基化反應，再按相同時間間隔，抽取混合溶液進行熒光信號檢測，記錄不同時間的信號值F₂；(3)分別計算不同時間的信號值F₂與信號值F₀(或信號值F₁)的差值或比率，進行DNA甲基化動態過程分析。本發明方法保證了反應的連續性，具有快速、便捷和自動化等特點。

技術領域

本發明屬于DNA甲基化檢測方法領域，特別涉及一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法。

背景技術

DNA甲基化是一種典型的表觀遺傳學修飾方式。在甲基轉移酶(Dnmt)的作用下，底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被催化，并轉移一個甲基至胞嘧啶的C5位置，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化與基因遺傳和胚胎發育密切相關，也是腫瘤等疾病的潛在標志物。DNA甲基化效率與Dnmt的活性和作用方式密切相關，因此，研究DNA甲基化生成機制和過程，對于分析Dnmt功能特性，理解表觀遺傳機制，探究細胞生長過程，以及診斷重大疾病具有重要意義。

常規的DNA甲基化檢測方法主要包括甲基化特異性PCR、甲基化敏感性單核苷酸引物擴增、重亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法、甲基化敏感性斑點分析、限制性標記基因組掃描、甲基化免疫沉淀等。這些方法主要針對DNA甲基化的整體水平和特異位點進行檢測，并被廣泛用于基礎和臨床研究。然而，此類方法只能測定靜態的DNA甲基化產物，對于動態的DNA甲基化過程缺乏有效的監測能力，這對于深入理解甲基化機制，精確研究甲基轉移酶活性，有效篩選酶抑制劑等產生了一定的阻礙。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法。本發明基于甲基轉移酶Dnmt3a和去甲基化酶TET2對不同狀態的甲基化DNA的敏感度，設計“平衡-反應-再平衡”的循環反應體系，并結合能量轉移(ET)效應(ET即兩種相聚較近的相同熒光基團，受到激發光刺激，轉而發射出同頻熒光能量，此同頻熒光能量以DNA雙鏈間π電子云為傳導途徑進行連接，產生1+12的信號效果)，建立一種快速、簡便的DNA甲基化動態過程連續在線檢測方法；當目標DNA被甲基化后，TET2會取代Dnmt3a結合于其上，此過程打破反應體系的靜態平衡，引發連鎖反應，產生熒光信號；通過持續檢測各反應階段的熒光信號，實現DNA甲基化過程的在線檢測。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種DNA甲基化過程的連續在線檢測方法，包括如下步驟：

(1)將熒光標記的羥甲基化DNA雜交鏈和過飽和的DNA去甲基化酶加入到溶劑中，混合均勻，得到混合溶液I，然后檢測混合溶液I的熒光信號，記錄信號值F₀；再將混合溶液I置于恒溫環境中溫浴，并檢測溫浴后的混合溶液I的熒光信號，記錄信號值F₁；

(2)將目標DNA雜交鏈、甲基轉移酶底物和甲基轉移酶加入至溫浴后的混合溶液I中，得到混合溶液II；然后將混合溶液II置于恒溫環境中進行甲基化反應，再按相同時間間隔，抽取混合溶液II進行熒光信號檢測，直至信號強度進入平臺期，記錄不同時間的信號值F₂；

(3)①分別計算不同時間的信號值F₂與信號值F₀的差值或比率，進行DNA甲基化動態過程分析；

或者是：

②分別計算不同時間的信號值F₂與信號值F₁的差值或比率，進行DNA甲基化動態過程分析。