[發明專利]一種誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法

在審

• 申請號: 201811354826.2
• 申請日: 2018-11-14
• 公開（公告）號: CN109315290A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 曾婉俐;蔣佳芮;許力;向海英;高茜;宋春滿;鄧樂樂;楊文武;張建鐸;李雪梅;張承明;楊光宇
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

本發明是一種誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法，通過種子消毒、種子培養、煙草外植體預培養、發根農桿菌培養、侵染與共培養、清洗與發狀根培養、發狀根愈傷組織培養、分化芽培養、再生植株生根培養等步驟完成。本發明針對煙草品種紅花大金元，利用發根農桿菌，通過調節植物激素比例，提高其外植體產生愈傷組織比率，可將煙草組織培養產生新植株的時間縮短至2個月并提高組培苗的生產率。另外，經過分化芽培養步驟，能大大提高分化芽的生根率和存活率。

技術領域

本發明屬于植物細胞工程技術領域，具體地說是一種發根農桿菌誘導煙草品種紅花大金元外植體產生毛狀根，并完成植株再生的方法。

背景技術

發根農桿菌是根瘤菌科（Rhizobiaceae）農桿菌屬（agrobacterium）的一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。Ri質粒是一種具有侵染性的大質粒，位于發根農桿菌染色體外。在實驗室條件下，發根農桿菌可以侵染人為劃傷的外植體傷口，以使Ri質粒上的T-DNA中含有的rolB基因能夠插入植物細胞核特定的基因當中，在宿主細胞內借助植物本身的DNA復制完成自身的復制與表達，合成特定的蛋白，從而誘導植株產生發狀根。發根農桿菌誘導植物細胞產生發狀根不僅能在無外源激素的培養基上快速自主生長，而且具有易通過組織培養途徑獲得再生植株等優勢。

ATCC15834發根農桿菌菌株來源于ATCC（美國模式培養物集存庫/American typeculture collection），為發根農桿菌原始菌株（wild strain），含有pRi15834農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的寄主范圍（禾本科、豆科、煙草等）。Ar.Qual發根農桿菌菌株含有農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的宿主范圍（玉米、煙草、番茄、柑橘等），同時具有鏈霉素、氯霉素抗性。MSU440發根農桿菌菌株含有農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的宿主范圍（玉米、煙草、茶樹、青蒿等），同時具有鏈霉素抗性。K599發根農桿菌（NCPPB2659）含有pRi12659農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的寄主范圍（葫蘆科、豆科、茄科等），同時具有鏈霉素抗性。

目前已有許多利用發根農桿菌誘導或轉化煙草的相關研究，然而，針對不同品種煙草的培養條件和步驟仍需探索改進，篩選合適的培養基和培養條件能有效提高獲得再生植株的效率。

發明內容

本發明的目的是公開一種發根農桿菌誘導煙草紅花大金元產生發狀根及植株再生的方法。

本發明的技術方案如下：

一種利用不同發根農桿菌菌種誘導煙草紅花大金元產生發狀根及植株再生的方法，包括如下步驟：

步驟（1），紅花大金元種子消毒；

步驟（2），種子培養，將步驟（1）中消毒的種子接種到MS培養基中，待發芽長成幼苗；種子發芽培養條件：溫度25±1℃，光照強度30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16h/d，培養60d；

步驟（3），煙草外植體預培養，將步驟（2）中得到的幼苗，利用手術刀將煙草葉片切成1cm²左右的葉盤，將葉盤置于MS培養基中進行預培養，培養條件為：25℃，黑暗培養3d；

步驟（4），發根農桿菌培養，發根農桿菌接種在YEB培養基上，28℃暗培養2-3d，挑取發根農桿菌單菌落接種于YEB液體培養基中28℃振蕩（200r/min）避光培養至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm離心15min收集菌體，用MS液體培養基懸浮菌體至OD600 =0.6-0.8，供感染使用，

步驟（5），侵染與共培養，將步驟（3）中預培養3d的煙草葉盤浸入步驟（4）懸浮菌液中10min，取出葉盤在滅菌濾紙上吸干菌液，并放至MS培養基上共培養，培養條件為：28℃，黑暗培養3d；