[發明專利]一種誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法

在審

• 申請號: 201811354826.2
• 申請日: 2018-11-14
• 公開（公告）號: CN109315290A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 曾婉俐;蔣佳芮;許力;向海英;高茜;宋春滿;鄧樂樂;楊文武;張建鐸;李雪梅;張承明;楊光宇
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

1.一種誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟（1），紅花大金元種子消毒；

步驟（2），種子培養，將步驟（1）中消毒的種子接種到MS培養基中，待發芽長成幼苗；種子發芽培養條件：溫度25±1℃，光照強度30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16h/d，培養60d；

步驟（3），煙草外植體預培養，將步驟（2）中得到的幼苗，利用手術刀將煙草葉片切成1cm²左右的葉盤，將葉盤置于MS培養基中進行預培養，培養條件為：25℃，黑暗培養3d；

步驟（4），發根農桿菌培養，發根農桿菌接種在YEB培養基上，28℃暗培養2-3d，挑取發根農桿菌單菌落接種于YEB液體培養基中28℃振蕩（200r/min）避光培養至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm離心15min收集菌體，用MS液體培養基懸浮菌體至OD600 =0.6-0.8，供感染使用；

步驟（5），侵染與共培養，將步驟（3）中預培養3d的煙草葉盤浸入步驟（4）懸浮菌液中10min，取出葉盤在滅菌濾紙上吸干菌液，并放至MS培養基上共培養，培養條件為：28℃，黑暗培養3d；

步驟（6），清洗與發狀根培養，將步驟（5）中共培養3d的葉盤取出，用含有250mg/L羧芐青霉素的無菌水清洗，在滅菌濾紙上吸干水分，置于含有250mg/L羧芐青霉素的MS培養基上進行發根培養，培養條件為：28℃光照培養16h/d，光照強度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培養8h/d，14d；

步驟（7），發狀根愈傷組織培養，將步驟（6）中從葉盤邊緣長出的發狀根切下，約1-1.5cm長，置于含有250mg/L羧芐青霉素的MS分化培養基中進行分化愈傷組織培養，培養條件為：28℃光照培養16h/d，光照強度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培養8h/d，14-21d，每10d更換培養基；

步驟（8），分化芽培養，將步驟（7）中已有分化芽形成的愈傷組織切下，置于含有250mg/L羧芐青霉素的MS培養基上進行培養，待愈傷組織上分化芽培養長至2-4cm高，培養條件為：28℃光照培養16h/d，光照強度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培養8h/d，10d；

步驟（9），再生植株生根培養，將步驟（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧芐青霉素的MS培養基上進行生根培養，培養條件為：28℃光照培養16h/d，光照強度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培養8h/d，7-10d。

2.根據權利要求1所述的誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法，其特征在于：步驟（1）中，種子消毒的具體步驟為：取飽滿的煙草種子，然后移至超凈工作臺上，用75％酒精將種子浸泡30s，無菌水沖洗2遍，再用1%AgNO₃消毒10min，無菌水浸泡清洗5次，用無菌濾紙吸干種子表面水分后進行接種，其中無菌水為經高壓滅菌的超純水。

3.根據權利要求1所述的誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法，其特征在于：步驟（2）、（3）、（4）、（5）中，MS培養基的制備方法如下：MS基本培養基中添加30g/L蔗糖，固體培養基中添加4g/L瓊脂，pH值為5.7。

4.根據權利要求1所述的誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法，其特征在于：步驟（4）中YEB培養基的制備方法如下：牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，固體培養基添加15g/L瓊脂；用于培養菌種Ar.Qual、K599和MSU440的YEB培養基需添加鏈霉素50mg/L。

5.根據權利要求1所述的誘導紅花大金元發狀根及植株再生的方法，其特征在于：步驟（4）中MS液體培養基為MS基本培養基中添加蔗糖30g/L，pH為5.7，121℃滅菌15min，冷卻后添加鏈霉素50mg/L，過濾滅菌，備用。